71198

-    czułość - najmniejsza ilość kw. Nukleinowego jaką można zidentyfikować z wykorzystaniem danego znacznika

-    rozdzielczość - najmniejsza odległość pomiędzy dwoma sygnałami jaką można używać dla danego znacznika

-    trwałość znacznika

-    bezpieczeństwo pracy - do eliminowania promieniowania

Oligonuklotydy		DNA	RNA
Długość	15-50 nukleotydów	100-do kilku tysięcy nukleotydów	Do kilku tys nukleotydów
Otrzymywanie	Synteza chemiczna	Klonowanie komórek DNA, PCR	Na bazie wstawki wektora -transkrypcja tRNA
Technika	Znakowanie	Na etapie	„run-off”
znakowania	końców	tworzenia w czasie PCR	transkrypcja w układzie plazmidów

-    syntezy znakowanych ss cząsteczek komplementarnych do ssDNA sklonowanego z użyciem uniwersalnego startera (oligonukleotydu komplementarnego do sekwencji wektora sąsiadującej ze sklonowanym DNA);

-    syntezy znakowanego RNA komplementarnego do poszukiwanej sekwencji metodą transkrypcji in vitro.

Sondami mogą być też nieradioaktywne substancje - do oligonukleotydu dołączane są enzymy o łatwo oznaczanej aktywności, biotyna, digoksygeniny, związki fluoryzujące. Produkty reakcji wykrywa się wówczas poprzez:

-    użycie streptawidyny, która wybiórczo wiąże się z biotyną, lub p/c monoklonalnych, skierowanych przeciwko biotynie czy digoksygeninie (p/c i streptawidyna są dodatkowo sprzężone z peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną.

-    enzymy, w obecności odpowiednich substratów, powodują reakcje barwne lub wywołują zjawisko chemiluminescencji.

Warunki hybrydyzacji (temperatura i siła jonowa) decydują o swoistości oddziaływań sondy z poszukiwaną sekwencją.

Schemat postępowania jest podobny niezależnie od rodzaju hybrydyzacji i obejmuje kilka