71216

Izolacja plazmidowego DNA na małą skalę (MINI-PREP)

Przebieg ćwiczenia

1. Z hodowli E. coli prowadzonej przez noc pobraliśmy 2 ml i żwirowaliśmy 1 minutę 6000 obr/min

2. Zlaliśmy pipetę supernatant, do osadu komórek dodaliśmy lOOul buforu GTE (50mM glukoza, 25 mM Tris-HCI, pH 8.0, 10 mM EDTA) i dokładnie zworteksowaliśmy. Dodać roztworu RNA-zy A do końcowego stężenia lOOug/ml

3. Dodaliśmy 200ul buforu do lizy i wymieszaliśmy przez odwracanie probówki. Pozostawiliśmy w temperaturze pokojowej na dokładnie 5 minut.

4. Dodaliśmy 150ul 3M octanu sodu (pH=4,8), wymieszaliśmy dokładnie przez odwracanie probówek. Umieściliśmy na lodzie na 10 min.

5. Wirowaliśmy próbki 10 min 13 000 obr/min.

6. Przenieśliśmy supernatant do świeżej probówki (probówki z pozostałym osadem wyrzucić), oszacować objętość. Dodaliśmy 2 objętości izopropanolu, wymieszaliśmy delikatnie przez odwracanie probówki i pozostawiliśmy w temp. pokojowej na 10-15 minut.

7.    Wirowaliśmy próbki 15 min. 13 000 obr/min.

8.0strożnie zlaliśmy supernatant, dodaliśmy do osadu 300ul 70% etanolu, wymieszaliśmy przez odwracanie probówki.

9. Wirowaliśmy próbki 5 min 13 000 obr/min.

10. Usunęliśmy supernatant, do osadu dodaliśmy 300ul 96% etanolu, wymieszaliśmy przez odwracanie probówki.

11. Wirowaliśmy próbki 5 min 13 000 obr/min.

12. Usunęliśmy dokładnie cały etanol, odwróciliśmy probówki do góry dnem i pozostawiliśmu otwarte na czystym ręczniku papierowym na ok. 5-10 min.

13. Rozpuściliśmy osad DNA w 30ul buforu TE.

Wynik:

Z hodowli E. coli które uległy transformacji wyizolowaliśmy osad DNA, który rozpuściliśmy w 30 pl buforu TE. Następnie wykorzystaliśmy go do analizy restrykcyjnej i PCR.