74652

western błot: Pierwszym etapem w metodzie wb jest rozdział białek za pomocą elektroforezy na żelu poliakryłamidowym. Najczęściej wykorzystuje się elektroforezę denaturującą z wykorzystaniem siarczanu dodecylu sodu (SDS-PAGE). Obecność SDS powoduje powstanie jego kompleksów z białkami. Kompleksy te mają ładunek ujemny co powoduje ich migrację w kierunku elektrody dodatniej, a cząsteczki białka rozdzielone są na podstawie ich mas cząsteczkowych. W kolejnym etapie niezbędny jest transfer uzyskanego rozdziału cząsteczek białka na membranę, aby umożliwić ich detekcję za pomocą przeciwciał. Najczęściej wykorzystywanymi w metodzie WB są membrany nitrocelulozowe lub membrany PVDF. Prążki z żelu na membranę przenoszone są poprzez transfer bezpośredni lub tzw.elektroblotting. W przypadku transferu bezpośredniego membranę układa się bezpośrednio na żelu a na niej umieszcza się kilka warstw bibuły filtracyjnej. Całość układu umieszcza się w buforze. Siły kapilarne wymuszają podsiąkanie buforu w kierunku warstw bibuły, podczas przechodzenia przez żel „porywa" on cząsteczki białka, które następnie zostają zatrzymane na membranie. Trzecim etapem metody WB jest zablokowanie wolnych miejsc na membranie. Ze względu na zdolność membrany dowiązania białka pozostawienie na niej „pustych" miejsc skutkowałoby niespecyficznym wiązaniem przeciwciała i bardzo silną emisją sygnału tła. Wolne miejsca na membranie blokuje się najczęściej poprzez umieszczanie jej w roztworze BSA lub odtłuszczonego mleka w proszku. Tak przygotowaną membranę można przeznaczyć do detekcji i analizy wyniku badań. W tym celu membranę umieszcza się w roztworze zawierającym przeciwciała.