84686

Przeszkody: sztywna ściana komórkowa, ujemny potencjał po zewnętrznej stronie błony komórkowej.

Fuzja protoplastów - fuzja wymuszona Protoplasty (komórka bez ściany komórkowej)

Sferoplasty (częściowo zachowana ściana komórkowa utrzymuje się na drodze enzymatycznej hydrolizy ściany komórkowej w warunkach zapewniających osmotyczną stabilizację struktury).

Związki wybrane do stabilizacji środowiska osmotycznęgo.

Pożywienie - toksyczność - nie hamuje

-    sole nieorganiczne, sacharydy, alkohole cukrowe w buforze Protoplasty bakterii:

Gram+ lizozym

Gram - lizozym + EDTA + warunki jonowe Protoplasty grzybów - sok żołądkowy ślimaka

Najłatwiej otrzymać protoplasty z komórek pochodzących z fazy wzrostu wykładniczego.

Protoplasty mogą łączyć się ze sobą gdy zbliżą się do siebie na odległość mniejszą niż lnm.

PEG-inicjator fuzji

Podczas fuzji tworzy się układ heterokariotyczny w którym z dużą częstotliwością następuje kariogamia i rekombinacja pomiędzy genoforami. Następnie w procesie samorzutnej lub indukowanej haploidyzacji następuje segregacja nowych genotypów. Protoplasty hoduje się potem w odpowiedniej pożywce.

Selekcja rekombinantów

Wymaga genetycznie trwałych markerów fizjologicznych. Najczęściej używa się szczepów auksotroficznych o różnych wymaganiach pokarmowych, mutantów oddechowych lub opornych na dany antybiotyk.

Zastosowanie fuzji protoplastów pozwala na rekombinację zarówno wewnętrzną jak i zewnątrzkomórkową oraz rekombinację więcej niż 2 genów.

Technologia rekombinacji DNA - przenoszenie genów z jednego organizmu na drugi. Otrzymuje się komórki zdolne do syntezy określonego białka.

Narzędzia rekombinacji

-    restryktazy - endonukleazy restrykcyjne - rozpoznają specyficzne sekwencje palindromowe, sekwencje w dwuniciowym DNA i hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w obu niciach w miejscu rozpoznanej sekwencji lub w niewielkiej odległości od tego miejsca.

-    metylazy - towarzyszą restryktazom (system chroniący) - metylują zasady purynowe i pirymidynowe w obrębie miejsca rozpoznawanego przez restryktazy w macierzystym DNA np. metylaza EcoRI.

-    egzonukleazy- hydrolizują 1-niciowe DNA lub RNA, usuwają fragmenty 1-niciowe lub 2-niciowe

-    fosfataza alkaliczna - usuwa końce 5' gr. Fosforanowej, linearyzacja wektora

-    odwrotna transkryptaza - synteza RNA komplementarnego do mRNA

-    polimerazy DNA - wykorzystywane do syntezy dwuniciowego DNA na matrycy jednoniciowej

-    lipaza - łączą polinukleotydy ufosforylowane w pozycji 5' do polinukleotydów posiadających wolne grupy 3'-OH

-    rybonukleazy- hydrolizują RNA

-    enzymy lityczne - do pozbycia się ściany komórkowej Technologie rekombinacji DNA - wektory

-    ogólnego zastosowania - pBR322

-    ekspresyjne do efektywnej syntezy białka

-    klonowanie sekwencji promotorowych

-    ekspresyjno - elekcyjne - do produkcji egzoproteiny

-    mutagenezy insercyjnej Klonowanie-etaov:

1.    Izolacja lub synteza genu

2.    Łączenie genu z wektorem