84762

•    ssDNA hybrydyzuje z nukleotydem

•    Przy użyciu polimerazy DNA i dNTP-ów otrzymujemy cząsteczkę typu dsDNA

•    Tym wektorem transformujemy komórki bakteryjne

•    W bakteriach zachodzi replikacja DNA i podział komórek. Replikacja dotyczy obu nici I

•    Otrzymujemy 2 typy komórek - jedne z DNA typu dzikiego a drugie ze zmutowanym DNA(obie nici) w zależności od nici macierzystej która została użyta do syntezy DNA tej komórki

•    Bakterie identyfikuje się po wysianiu na podłoże stałe w odpowiedniej gęstości tak by możliwe było rozróżnienie klonów.

•    Problemy pojawiają się w komórce na poziomie replikacji (?) ale sama metoda jest łatwa

Poszczególne metody mutagenezy różnią się wydajnością gdyż metody te mają różne cele i problemy do rozwiązania

Mutageneza przy pomocy PCR (mutageneza z wykorzystaniem megaprimera)

(e) PCR mutagenesis

•    1 st PCR to obtain long primer

product Q";j i i ri

•    2nd PCR using long primer

o-

product

11 i 11 i} i i rrr

•    Istotą techniki megaprimera(mega startera) jest to że wykonujemy 2 reakcje PCR

•    Technika ta jest bardzo wydajna dla wprowadzania mutacji punktowych - jeśli wszystko jest dobrze wykonane to mamy praktycznie 100% pewność że mutacja została wprowadzona

•    W pierwszej reakcji korzystamy z 2 starterów - jeden zawiera mutację(forward - przedni) i ją wprowadza a drugi nie zawiera mutacji

•    Otrzymujemy produkt w którym jest mutacja

•    W drugiej reakcji znowu posługujemy się dwoma starterami: starter przedni nie zawiera mutacji a drugim starterem jest produkt reakcji pierwszej - jest bardzo długi więc jest megaprimerem

•    Po wykonaniu drugiego PCR otrzymujemy produkt który jest identyczna do sekwencji wyjściowej z tą różnicą że wprowadziliśmy mutację

•    Metoda nie jest prosta gdyż używamy mega starter