3389187621

Ćwiczenie 2

Barwienie przyżyciowe komórek nowotworowych

Celem takiego barwienia jest odróżnienie komórek żywych od martwych. Proces barwienia tkanek czy komórek ma charakter fizykochemiczny i polega na adsorpcji barwnika na ścianie komórkowej lub jego dyfuzji do wnętrza komórki. W barwieniu stosuje się najczęściej barwniki zasadowe (sole, w których jonem barwnym jest kation np.: błękit metylenowy, fiolet krystaliczny), wykorzystując ich powinowactwo do składników komórek (mających odczyn kwaśny). Cechą charakterystyczną barwników przyżyciowych jest ich niska toksyczność w stosunku do barwionych komórek .

■    Materiał

Komórki ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60.

■    Sprzęt

Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, probówki Eppendorfa, pipety

automatyczne, worteks.

■    Odczynniki

0,04% wodny roztwór błękitu metylenowego.

■    Wykonanie

Pobrać do probówki Eppendorfa 0,5 ml zawiesiny komórek ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60. Dodać 20 pl roztworu błękitu metylenowego. Całość wymieszać na worteksie i po 10 minutach nanieść kroplę zawiesiny komórek na szkiełko podstawowe. Przy powiększeniu 40x zaobserwować stosunek komórek żywych do martwych. Wykonać rysunek. Wyjaśnić, dlaczego komórki martwe barwią się, natomiast komórki żywe pozostają bezbarwne.

Ćwiczenie 3

Barwienie preparatów utrwalonych komórek nowotworowych

Konieczność stosowania materiału utrwalonego w cytologii jest podyktowana dużą toksycznością specyficznych barwników i odczynników oraz niebezpieczeństwem zniekształceń, powstałych w trakcie niekontrolowanego zamierania komórek. Utrwalenie materiału ma na celu bardzo szybkie zabicie komórek z zachowaniem struktur komórkowych w stanie jak najmniej zmienionym w porównaniu z komórką żywą. Dobry utrwalacz składa się ze środka utrwalającego i nośnika zapewniającego stałe pH w trakcie utrwalania oraz odpowiedni skład jonowy aby nie dopuścić do wytrącania i ekstrakcji materiału. Do prostych utrwalaczy zaliczane są: alkohol etylowy, aceton, kwas octowy czy aldehyd glutarowy. Utrwalacze złożone to np. płyn Camoy’a cechujący się szybką penetracją komórki, korzystnym wpływem na ich morfologię oraz barwliwość chromosomów.

■    Materiał

Komórki ludzkiego raka jelita grubego HT29 rosnące na szkiełkach nakrywkowych.

■    Sprzęt

Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, komory do barwienia, szalki Petriego, pęseta, pipety automatyczne.

■    Odczynniki

Utrwalacz Carnoy’a: alkohol metylowy i lodowaty kwas octowy zmieszane w stosunku objętościowym 3:1 1 % kwas octowy