img098

rozcieńczeniu, np. barwienie komórek drożdży przy oznaczaniu ich żywotności. Celem tego barwienia jest przeważnie odróżnienie komórek żywych od martwych. Zabarwieniu ulegają komórki martwe, w których została uszkodzona błona komórkowa, a komórki żywe pozostają bezbarwne. Do barwienia najczęściej stosuje się błękit metylenowy w rozcieńczeniu 1: 10 000.

3.3.3. Sporządzanie preparatów barwionych

Barwienie preparatów utrwalonych obejmuje trzy etapy i wymaga:

•    wykonania rozmazu,

•    utrwalenia preparatu,

•    zabarwienia preparatów.

Rozmaz. Sporządza się go na szkiełku przedmiotowym z naniesionego na nie materiału, jak przy wykonywaniu preparatu wilgotnego, posługując się ezą. Następnie rozmaz należy wysuszyć w powietrzu atmosferycznym.

Utrwalanie preparatu. Stosuje się w celu zabicia drobnoustrojów i przytwierdzenia ich do szkiełka podstawowego. Można przeprowadzać je metodą termiczną lub chemiczną.

Metoda termiczna. Polega na trzykrotnym powolnym przeciągnięciu szkiełka przedmiotowego z wysuszonym rozmazem w płomieniu palnika. Szkiełko należy trzymać szczypcami Cornetta, zwrócone rozmazem do góry.

Metoda chemiczna. Polega na zalaniu wysuszonego rozmazu odpowiednim związkiem chemicznym (alkoholem, eterem, formaliną) i pozostawieniu go na kilka minut. Po wyschnięciu preparatu można go barwić wybraną metodą.

Barwienie proste, pozytywne metodą Loffłera. Metoda polega na wybarwieniu komórek (w utrwalonym preparacie) błękitem metylenowym przez 5 min. Następnie preparat należy spłukać wodą i wysuszyć. Komórki obserwowane pod mikroskopem mają zabarwienie niebieskie. Ten sposób barwienia jest bardzo często stosowany w mikrobiologii.

Barwienie proste, negatywne. Metoda ta polega na uzyskaniu kontrastu między ciemnym tłem a niewybarwionymi komórkami. Do barwienia negatywnego najczęściej używa się barwników gruboziarnistych, jak: tusz chiński, nigrozyna. Barwnika dodajemy do zawiesiny na szkiełku i mieszamy, następnie drugim szkiełkiem robimy rozmaz (rys. 3.2). Preparat suszymy (nie utrwalamy) i oglądamy pod mikroskopem.

Barwienie złożone, negatywno-pozytywne. Jest kombinacją barwienia negatywnego i pozytywnego. Zasada tego barwienia polega na stosowaniu jednego z wymienionych przy metodzie negatywnej barwników gruboziarnistych (np. tuszu chińskiego), z którym miesza się zawiesinę bakterii i rozprowadza ją na szkiełku. Preparat suszy się (nie utrwala!) i zabarwia komórki właściwym barwnikiem, najczęściej fuksyną przez 30 s. Przykładem tego barwienia jest barwienie metodą Burri-Ginsa. Wykonuje się je w następujący sposób:

31