2808184602

IZOLACJA DNA

Cel:

•    Wysokocząsteczkowy preparat (20-50kpz)

•    Wysoki stopień czystości (DNA pozbawiony białeki inhibitorów enzymów)

•    Wysoka wydajność

Ogólne zasady izolacji zbliżone dla DNA pozyskiwanych z różnych komórek (bakterie, rośliny, zwierzęta)

I    etap: Mechaniczna maceracja tkanki lub liza komórek

II    etap: Wyśnienie białek z lizatu, odbiałczenie preparatu poprzez ekstrakcję fenolem i chloroformem

III    etap: Usunięcie zanieczyszczeń chemicznych (precypitacja etanolem), rozpuszczenie osadu DNA w buforze (TE)/ wodzie.

Wybór metody zależy od dalszego przeznaczenia preparatu.

Najwyższą czystość uzyskuje się poprzez wirowanie w gradiencie gęstości CsCl lub czyszczenie na kolumnach chromatograficznych.

Ilościowa i jakościowa ocena preparatu DNA:

Spektrofotometryczny pomiar absorbancjji (A) wUV A2so=l dla:

•    dsDNA o stęż 50pg/ml

•    ssDNA o stęż 33pg/ml

•    RNA o stęż 40pg/ml

Różnice w absorbancji to wynik złożoności struktury DNA i RNA.

Stężenie dsDNA oblicza sę wg wzoru;

C(pg/ml)= (Amo/Am)) x 50 x rozcieńczenie

Wartość Aaso/Aa* świadczy o stopniu zanieczyszczenia białkami A260/A300- zanieczyszczanie związkami chemicznymi.

Wartość 1,8-2-wysoka jakość preparatu.

Kształt i max wartości widma UV- informacja a stopniu i typie zanieczyszczeń DNA zwchem stosowanymi podczas izolacji (np. fenol).

Każdy z nich wykazuje inne, charakterystyczne dla siebie cechy

(zalecane wykonanie pomiaru A przy kilku dł fali, a przy ostatecznej ocenie jakości DNA uwzględnić tzw tło).

Aktywność biologiczna preparatów DNA:

Oceniana jest m.in na podstawie podatności DNA na hydrolizę restryktazami.

Porównanie obrazu preparatów niestrawionych i trawionych (po elektroforezie) informuje o ich jakości.

Nietrawione DNA- brak efektów niespecyficznej degradacji.

Po wybarwieniu żelu kończącego elektroforezę widoczny pojedynczy „prążek" (homogenna frakcja fragmentów DNA tej samej długości 25-50kpz),

DNA trawione ednonukleazami- efekt odwrotny, tj populacja licznych fragmentów DNA różnych wielkości (genomowe DNA). Smuga powstała w wyniku rozdrobnienia, fragmenty nakładające się na siebie.

W przypadku plazmidowych DNA- kilka różnych farm, każda migruje w żelach z inną prędkością. Różnica w obrazie plazmidów trawionych i nietrawionych restryktazami.