6827068700

Cytogenetyka roślin

Wykład 2. Metody klasyczne analizy kariotypu. Typy sekwencji DNA jądrowego i ich detekcja, analiza oraz obrazowanie (mitoza/mejoza).

1. Przygotowanie materiału roślinnego do klasycznej analizy kariotypu.

Przed utrwalaniem preparatu komórkowego potrzebnego do wykonania analiz kariotypowych należy najpierw nagromadzić dużą ilość komórek roślinnych w stadium metafazy na materiale żywym co umożliwi uzyskanie maksymalnie skróconych chromosomów. Można wykorzystać do tego kilka odczynników:

•    woda z lodem;

•    8-hydroksychinolina;

•    kolchicyna;

•    a-bromonaftalen.

Po otrzymaniu odpowiedniej próby badawczej, należy ją utrwalić mieszaniną lodowatego kwasu octowego i alkoholu etylowego lub metylowego w stosunku 3:1. Wykonanie preparatów można wykonać przy użyciu kilku metod:

•    metoda zgniatania (maceracja w HC1 + barwienie + rozgniot);

•    metoda maceracji enzymatycznej (maceracja w mieszaninie enzymów + rozgniot);

•    metoda nakraplania (otrzymywanie mieszaniny protoplastów po trawieniu enzymami). Takie preparaty następnie należy wybarwić w celu uwidocznienia interesujących nas struktur. W zależności od przeznaczenia preparatu wykonuje się:

•    barwienie proste, które umożliwia:

o niespecyficzne, równomierne wybarwienie chromatyny interfazowej i chromosomów mitotycznych;

o określenie liczby chromosomów, poziomu ploidalności, przemian chromosomowych;

o identyfikację chromosomów mitotycznych na podstawie morfologii (długość całkowita, położenie centromeru, długość ramion, obecność przewężenia wtórnego):

■    acetoorceina, acetokarmin;

■    metoda Feulgena - uwidacznia grupy aldehydowe w DNA (można używać także w mikroskopie fluorescencyjnym):

•    maceracja w HC1 - pękanie pierścienia pentozowego dezoksyrybozy i wytworzenie grupy aldehydowej;

•    odczynnik Schiffa (parafuksyna) - barwienie grupy aldehydowej.

Rysunek 1. i 2. Chromosomy barwione metodą Feulgena oraz acetokarminem

• barwienie różnicowe:

11