Następnie wykreśla się krzywą wzorcową (Rysunek 1) A = /(c), która przy idealnym spełnieniu prawa Lamberta-Beera jest linią prostą o nachyleniu kl, przechodzącą przez początek układu współrzędnych. Krzywa wzorcowa służy do bezpośredniego odczytu stężenia badanej substancji na podstawie pomiaru absorbancji jej roztworu przy określonej długości fali.
Stężenie metalu, mg/cm3
Rysunek 1. Przykładowa krzywa wzorcowa.
Ważne jest, aby próbki o nieznanej zawartości Fe3+ lub Cu2+ przygotować w warunkach identycznych jak dla roztworów wzorcowych (ilość odczynnika kompleksującego, pH, temperatura, warunki pomiaru absorbancji: długość fali, grubość kuwety).
Oznaczenie spektrofotometryczne wykonywane na ćwiczeniach obejmuje:
• wykonanie krzywej wzorcowej dla roztworów wzorcowych Fe3+ lub Cu2+,
• oznaczenie zawartości Fe3+ lub Cu2+ w badanej próbce.
Jony Fe3+ tworzą z jonami rodankowymi SCN- (tiocyjanianowymi) w środowisku kwaśnym czerwone kompleksy zgodnie z poniższymi równaniami:
Fe3+ + SCN" -► Fe(SCN)2+,
Fe(SCN)2+ + SCN" [Fe(SCN)2]+, itd. aż do:
[Fe(SCN)5]2" + SCN" -> [Fe(SCN)6]3".
W roztworach rozcieńczonych stosowanych w spektrofotometrii występują głównie kompleksy Fe(SCN)2+. Intensywność zabarwienia roztworu jest wprost proporcjonalna do stężenia jonów Fe3+. Z charakterystycznej dla oznaczanego kompleksu krzywej absorpcji, czyli zależności absorpcji światła od długości fali X, wyznacza się Xmax., tzn. długość fali, przy której analizowana próbka wykazuje największą absorbancję (Rysunek 2).
Przygotowanie krzywej wzorcowej dla oznaczania Fe3+: