7581047915

Streszczenie

STRESZCZENIE

Przedmiotem badań było określenie przydatności termofilnej bakterii Thermus ruber jako źródła tennostabilnej a-glukozydazy i syntazy trehalozy. Hodowlę drobnoustroju prowadzono w temperaturze 55 °C na podłożu zawierającym 0,5 % peptonu K, 0,1 % ekstraktu drożdżowego oraz 0.1 % skrobi. Badania aktywności ekstraktu białek komórkowych Thermus ruber względem różnych substratów wykazały, że badany mikroorganizm posiada też enzymy o aktywności P-galaktozydazy oraz w znacznie mniejszym stopniu aktywności p-glukozydazy. Ekstrakt bezkomórkowy wykazuje także niski stopień aktywności względem polisacharydów oraz nieznaczną aktywność proteolityczną. Zawierający a-glukozydazę i syntazę trehalozy ekstrakt białek komórkowych otrzymywano poprzez ucieranie mokrej biomasy z Al₂Cf (2:1 w/w) oraz z 0,01 M buforem fosforanowym o pH 6.2 stopniowo dodawanym w ilości 7:1 (v/w). Podczas logary tmicznego wzrostu Thermus ruber aktywność a-glukozydazy w hodowli jest skorclow ana (r=0.98) z przy rostem ilości komórek. Wytwarzany enzym nie jest transportów any do podłoża, w którym stw ierdzono zaledw ie 6.7 % ogólnej aktyw ności ekstraktu bezkomórkowego. Dodane do pożywki węglowodany (skrobia, maltoza, trehaloza. sacharoza) powodowały przy rost biomasy w porów naniu z hodow lą kontrolną prowadzoną na podłożu zawierającym ekstrakt drożdżowy

1    pepton K bez dodatku cukrów. Największy przyrost biomasy' (1,8-krotny) następował w hodowli zawierającej

2    % skrobi. Przy 1 % stężeniu NaCl w pożywce następowało stopniowe zmniejszenie wydajności biomasy, a jednocześnie zwiększenie aktywności a-glukozydazy do 0,38 U/mg. Poddanie komórek drobnoustroju stresów i osmoty cznemu 7.5 % roztw orem NaCl powodowało wzrost aktywności ogólnej a-glukozydazy o około 12 %, nie wpływając znacząco na wytwarzanie syntazy trehalozy. Największą aktywność a-glukozydazy wykazała frakcja białek wysolona z ekstraktu bezkomórkowego przy 45 % nasyceniu siarczanu (VI) amonu (0,43 U/mg białka). Oczyszczanie a-glukozydazy z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej (DEA Fractoflow 80-6) i filtracji żelowej na złożu Sephadex G-100 powodowało 53-krotny wzrost aktywności specyficznej preparatu. Masa cząsteczkowa a-glukozydazy wyznaczona z zastosowaniem chromatografii żelowej wynosi 43,5 kDa. a za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym 43 kDa. Badany enzym przejawia maksymalną aktywność w temperaturze 65 °C przy' pH 6,0 i zachowuje on około 80 % największej aktywności w zakresie pH od 5,5 do 6.5. a-Glukozydaza z Thermus ruber charakteryzuje się wysoką stabilnością w zakresie pH 5,5-7,5 i zachowuje ponad 90 % aktywności początkowej podczas dwugodzinnej inkubacji w tym zakresie pH. Charakterystyczną cechą wymienionej a-glukozydazy jest 35-krotnie większa aktywność względem GlcapNp niż maltozy', co wskazuje na przynależność tego enzymu do pierwszej grupy a-glukozydaz. Wartość stałej Michaelisa (K_m) podczas hydrolizy GlcapNp wynosi 0,09 mM, a V_max reakcji wynosi 0,92 pmol/min. Zaobserwowano dość silne oddziaływanie inaktywujące mocznika i chlorowodorku guanidyny na aktywność a-glukozydazy. Aktywność a-glukozydazy obniżały również SDS. EDTA. PCMB. kwas jodooctowy i jodoacetamid. W przy padku niejonowego detergentu Tritonu X-100 nie stwierdzono dużych różnic stopnia inaktywacji (50 % początkowej aktywności) enzymu w zakresie stężeń 0,1-2,5 %. Dalszy wzrost stężenia Tritonu X-100 nie powodował już istotnych zmian aktywności preparatu. Silne oddziaływanie inakty wujące powodowały także jony Hg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺i Fe²⁺. Znaczne oddziały wanie inaktywujące wywierała glukoza, słabsze ksyloza i galaktoza. Maltoza powodowała natomiast niewielką aktywację badanego enzymu. Wzrost aktywności badanego enzymu następował pod wpływem kationów Mg²*, Mn²⁺oraz K⁺. Jony Ca²⁺ nie zmieniały w istotnym stopniu aktywności badanego białka. Równoczesne zastosowanie preparatu a-glukozydazy z Thermus ruber oraz handlowego preparatu glukoainylazy AMG 300L podczas hydrolizy roztworu skrobi wykazało zwiększenie szybkości wytwarzania glukozy w stosunku do efektywności samej glukoainylazy, co świadczy o możliwości zwiększenia wydajności scukrzania syropów skrobiowych. a-Glukozydaza z Thermus ruber, podobnie jak badana syntaza trehalozy, jest zlokalizowana głównie w strukturach błonowych drobnoustroju. Wytwarzana przez Thermus ruber sy ntaza trehalozy jest enzymem wew nątrzkomórkowy m, gdyż stw ierdzono brak jego aktywności w cieczy pohodowlanej. Stymulatorami syntazy trehalozy są maltoza i skrobia powodujące ponad 2.5-krotne zwiększenie ilości wytwarzanego w komórkach enzy mu. Ekstrakt białek komórkowych z Thermus ruber posiada aktywność syntazy trehalozy wynoszącą 0,028 U/mg białka, która po dodaniu do pożywki 0,5 % maltozy wzrasta do wartości 0.086 U/mg białka. Strącenie białek z ekstraktu przy 45 % nasyceniu siarczanu (VI) amonu powodowało około 2-krotne podczyszczenie enzymu, który zachowuje około 67 % ogólnej aktywności ekstraktu bezkomórkowego. Badany sy ntaza trehalozy przejawia maksymalną aktywność w temperaturze 65 °C przy pH 6,5. Godzinna inkubacja enzy mu w zakresie temp. 40-60 °C w środowisku buforu fosforanowo-cytiynianowego o pH 6,0 i 7,0 nie powodowała istotnych strat aktyw ności preparatu. Badany enzym jest nieaktywny w zględem skrobi, amylozy. inaltooligosaclrary dów. celobiozy, laktozy i glukozy. Maksymalny stopień konwersji wynoszący około 90 % uzyskano przy 10 % stężeniu maltozy w temperaturze 65 °C w ciągu 2 godzin.

6