1629289699

warunków eksperymentalnych, podstawy procesu elektroforetycznego rozdziału, techniki otrzymywania homogenatu białkowego i odpowiedniego przygotowania prób przeznaczonych do mapowania: wstępne frakcjonowanie ekstraktów białkowych (prefractionaction), zmniejszenie obciążenia żelu próbką, podział na subpopulacje białkowe (subproteomika), użycie zestawów analitycznych (kits). Omówione będą etapy przygotowania pasków IPG (rehydratacja, ekwilibracja), problemy związane z powtarzalnością wyników i obiektywizacją danych, artefakty, zgodność z innymi technikami analitycznymi, sposoby analizy danych, metody porównawczej analizy żeli (matching), rozwój automatyzacji i robotyzacji w analizie chromatogramów 2D oraz nowe koncepcje poprawiające rozdzielczość - żele typu ultrazoom, paski typu narrow-range pH, optymalizacja barwienia w SDS-PAGE, standaryzacja procedur. Przedstawione zostaną podstawowe narzędzia bioinformatyczne: algorytmy dla konstrukcji sieci informatycznych 2D (Mr-pl), bazy danych 2DE (np. PDQUEST, ExPASy), a także nowoczesne techniki analizy proteomów z wykorzystaniem 2DE: DIGE (difference in-gel electrophoresis), BN (blue-native)/SDS-PAGE. Prezentacja powyższych zagadnień będzie wsparta konkretnymi przykładami metod optymalizacyjnych 2DE, stosowanych w badaniach proteomów szczególnie trudno poddających się analizie. W dalszej części kursu nastąpi omówienie problematyki identyfikacji białek w proteomice analitycznej: konieczność proteolitycznej degradacji białek - przygotowanie prób do badań MS, podejścia badawcze stosowane w celu identyfikacji białek proteomu: (1) metody bezpośredniej analizy proteomu poprzez zastosowanie mikromacierzy białkowych (protein chips, microarrays, mikromacierze odwróconej fazy, technika SELDI - Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization), (2) analiza elektroforegramów 2-DE - katalogizacja proteomów i tworzenie map białkowych 2DE, (3) analiza odcisku palca mapy peptydowej (Peptide Mass Fingerprinting, PMF) w badaniach MS, (4) mikrosekwencjonowanie - sekwencjonowanie de novo na podstawie wyników MS. Przedstawione zostaną - wraz z przykładami - alternatywne schematy postępowania w proteomice porównawczej i funkcjonalnej, wraz z najnowocześniejszymi strategiami i metodami badawczymi: LC-MS, 2D-LC-MS, CE-MS, sposoby znakowania populacji białkowych w różnicowej analizie ekspresji białek: (a) metaboliczne (in vivo-SILAC, Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Celi Culture), (b) chemiczne (ICAT, Isotope-Coded Affinity Tag, iTRAQ), (c) znakowanie enzymatyczne (in vivo-180). Część teoretyczna kursu, charakteryzująca zasady analizy proteomicznej zostanie zilustrowana przykładami zastosowań naukowo-badawczych, obejmujących m.in.: fosfoproteomikę i detekcję zmian posttranslacyjnych w białkach, subproteomikę i analizy proteomów organelli; metaproteomikę - analizę proteomów w układach konsorcjów drobnoustrojów, proteomikę w technologii żywności, proteomikę kliniczną (LCM, laser tissue microdissection, techniki whole body array przy analizie zmian nowotworowych), farmakoproteomikę, proteomikę roślin.

Ćwiczenia: Ćwiczenia laboratoryjne, wykonywane w czterech blokach po 7,5 godzin, przewidziane są jako całościowe mini-projekty badawcze, pozwalające poznać elementy proteomiki funkcjonalnej oraz proteomiki ekspresji białek. Celem ćwiczeń jest zbadanie wybranych mechanizmów indukcji/represji szlaków metabolicznych przemian ksenobiotyków u niekonwencjonalnych drożdży. W trakcie cyklu zajęć wykonają doświadczenia nad modulacją metabolizmu związków jednowęglowych i/lub węglowodorów alifatycznych przez mikroorganizmy eukariotyczne, z wykorzystaniem odpowiednio dobranych induktorów ekspresji genów, a także substratów wywołujących zjawisko represji katabolicznej. Jako materiał biologiczny wykorzystane zostaną, wariantowo, wyizolowane ze środowiska drożdże rodzaju Candida, Hansenula oraz Trichosporon. Aktywność metaboliczna będzie obserwowana za pomocą mikrobiorekatorów (Cerko-Lab System), umożliwiających ciągły i zautomatyzowany pomiar wybranych parametrów procesowych, takich jak konsumpcja tlenu, zmiany pH w podłożu, zmiany przewodnictwa. Białkowe ekstrakty komórkowe otrzymane z