2906542626

Zwielokrotnienie zwierzęcego genu, jego klonowanie i ekspresja w komórce bakteryjnej

Od blisko trzydziestu lat wiadomo, że w wielu tkankach i komórkach zwierzęcych opornych na cytostatyczne działanie ametopteryny zawartość białka reduktazy redukującej folian i dihydrofolian ¹) przewyższa wielokrotnie jej zawartość w tkankach i komórkach wrażliwych. Dopiero jednak w 1976 roku Robert T. Schimke (1,2) i John W. Littlefield (3) selekcjonując komórki rosnące w obecności coraz to zwiększonych ilości ametopteryny ²> w pożywce stwierdzili niezależnie, że wzrost zawartości białka enzymatycznego w komórkach opornych wynika ze wzmożonej syntezy enzymu. W 1978 roku zaś R. T. Schimke wykazał wraz z współpracownikami, że wzmożona synteza enzymu jest konsekwencją zwielokrotnienia właściwego genu (4,5). W komórce zwierzęcej zatem regulacja syntezy białek może zachodzić nie tylko na etapach transkrypcji i translacji, lecz także w efekcie selektywnego zwielokrotnienia kodującego te białka DNA. Co więcej, w komórkach każdej kolejno badanej opornej linii zwielokrotnienie ilości kodującego DNA i ilości białka enzymatycznego było takie samo; w przypadkach niektórych linii nawet czterokrotne (5,7,8). Wykazano ponadto, że zwielokrotnienie genu może być efektem trwałym lub też przejściowym, odwracanym po usunięciu czynnika wywołującego; w danym przypadku po przeniesieniu komórek do pożywki nie zawierającej ametopteryny (4, 8). Oznacza to, że genom komórki zwierzęcej nie jest tak stałą całością (constant entity), jak dotąd sądzono (4,5,9).

Stwierdzenie selektywnego zwielokrotnienia genu strukturalnego w komórkach ssaków nasunęło pytanie: gdzie znajduje się fragment genomu ulegający powieleniu i czy w procesie tym odgrywają rolę jakieś szczególne sekwencje nukleotydów w DNA.

Aby odpowiedzieć na pierwsze z postawionych pytań R. T. Schimke i jego współpracownicy posłużyli się trwale oporną na aminopterynę linią komórek chomika chińskiego. Wykazali, że chromosom drugi uległ w nich znacznemu powiększeniu, a jego homogennie barwiące się Giemzą po traktowaniu trypsyną, powiększone ramię zawiera DNA komplementarny wobec mRNA mysiej reduktazy dihydro-folianowej, a zatem geny reduktazy dihydrofolianowej w komórkach chomika zidentyfikowano w homogennie barwiącym się regionie drugiego chromosomu (7).

W początkowej fazie szukania odpowiedzi na drugie pytanie autorzy podjęli próbę klonowania genu mysiej reduktazy dihydrofolianowej w komórkach bakteryjnych (6). A ponieważ reduktazy zwierzęca i bakteryjna różnią się znacznie powinowactwem do folianu i niektórych inhibitorów dają się łatwo odróżnić przy zastosowaniu prostych testów biologicznych i biochemicznych.

1

Oksydoreduktaza 5,6,7,8-tetrahydrofolian:: NADP b (E.C. 1.5.1.3) zwana potocznie reduk-tazą dihydrofolianową.

2

Na temat cytotoksycznego działania ametopteryny metabolizmu folianu i jego amino-analogów opublikowano w Postępach Biochemii w ostatnich latach następujące artykuły:

1)    Manteuffel-Cymbrowska M. (1978) 24, 93—115,

2) Grzelakowska-Sztabert B. (1977) 23, 559—578,

3) Grzelakowska-Sztabert B. (1976) 22, 345—385.