2906543832

128

ułatwienia kontaktu protoplastów stosuje się manipulacje mikroigłą oraz metody wirowania kombinowane z działaniem NaN0₃. Na przebieg fuzji ma także wpływ delikatne traktowanie membran aktywnym enzymem typu lizozymu i działanie specyficznych substancji jak np. glikol polietylenowy (PEG), który zwiększa procent zlewających się protoplastów.

TETRADY -- ROŚLINY -► KULTURY KOM.

PROTOPLASTY PROTOPLASTY PROTOPLASTY

HAPLOIDY

DIPLOIDY

DIPLOIDY

KOM. _ KOM.    KOM.

HYBRYDY PRZEKSZTAŁCONE HYBRYDY KOMÓRKOWE KOMÓRKI    KOMORKOWE

Ryc. 6. Diagram obrazujący metody doświadczeń genetycznych z użyciem protoplastów

Identyfikacja heterokarionów w doświadczeniach z fuzjami wymaga istnienia pewnych markerów, np. barwnych protoplastów. Używa się więc zielonych protoplastów izolowanych z liści lub protoplastów

0    innych kolorach izolowanych z płatków kwiatowych (antocyjany) i pozbawionych barwy protoplastów izolowanych z kultur komórkowych. Dzięki temu jest możliwe wyselekcjonowanie mozaikowych (chimerycznych) mutantów komórkowych, zawierających dwa różne genotypy. Pierwszą udaną próbą było zregenerowanie komórek otrzymanych z fuzji protoplastów 2 gatunków Nicotiana do płodnej amfiploidalnej rośliny. (Ze zlania dwóch komórek somatycznych o di-ploidalnej liczbie chromosomów (2n) powstanie hybryd komórkowy zawierający 4 n chromosomów czyli tetraploid, nazwany również amfiploidem).

Możliwość indukowania fuzji międzygatunkowych

1    międzyrodzajowych daje szansę produkowania mieszańców, których komórki będą kombinacją genotypów roślin, jakich nie można otrzymać w normalnych warunkach płciowego rozmnażania (ryc. 8). Użycie dla powyższych badań haploidalnych protoplastów otrzymanych z komórek po podziale mejotycznym (tetrady), zwiększa możliwości badawcze w kierunku uzyskania roślin homozygotycznych i dalszego ich krzyżowania poprzez fuzje protoplastów. Ażeby rośliny wyrosły z hybrydów niezbędne jest jak już wiemy ustalenie koniecznych wymogów dla dalszej hodowli mieszańcowych komórek i ich organogenezy. Mimo zastosowania różnych kombinacji hormonów w bogatych pożywkach nie zawsze regeneracja będzie możliwa. Na przeszkodzie mogą stanąć ograniczenia natury technicznej oraz ciągle jeszcze zbyt mały zakres wiedzy o zjawisku totipotencji komórek.

Ryc. 7. Połączenie protoplastów Pisum sativum i Vicia hajastana. Wg Kao i Michayluk 1974

Protoplasty są zdolne do pobierania różnych makro-molekuł i organelli. Opublikowano pTace o włączaniu kwasów nukleinowych wirusów roślinnych lub bakterii do protoplastów. Na tej podstawie można stworzyć wizję protoplastów zdolnych do pobrania chromosomów, jąder czy chloroplastów innych gatunków roślin. I już pewne próby w tym kierunku są czynione. V a s i 1, Giles (1975) obserwowali pobieranie chloroplastów szpinaku przez protoplasty grzyba Neurospora crassa.

Doświadczenia tego typu mają na celu zmodyfikowanie genetyczne i funkcjonalne komórki roślinnej.

Ryc. 8. Heterokariocyt Vicia hajastana — Glycine ma-xima podczas mitozy. Wg Kao et al. 1974

Polegają one na przenoszeniu genów (specyficznych, liniowych układów nukleotydów w DNA lub RNA) z jednej komórki do drugiej i poprzez integrację z materiałem genetycznym protoplastu uzyskaniu przez niego pewnych cech dawcy. Dla organizmów wyższych zjawisko to zostało nazwne transgenozą. A ujawnione nowe cechy potwierdzają integrację i aktywność genu.

Dotychczasowe prace mają charakter wstępny, dalsze badania są niezbędne dla wyjaśnienia mechanizmu obserwowanych zjawisk i skuteczności stosowanych metod.

Nie ulega wątpliwości, że biologia wolnych protoplastów należy do nowoczesnego, szybko rozwijającego się kierunku badań o szerokich perspektywach.