3110398629

Otrzymywanie frakcji polisacharydowych

Grzyby wykorzystane do przygotowania próbek zostały zebrane w sadzie kasztanowym (w Macedo de Cavaleiros oraz w lesie mieszanym sosnowo-dębowym w Viła Real (41° 19' N i 7° 44' W, 479 m npm) w Portugalii. Identyfikacja grzybów i potwierdzenie ich przynależności do gatunków Boletus edulis i Cantharellus cibarius zostało wykonane przez specjalistę z dziedziny mikologii. Reprezentacyjne próbki zebranych gatunków grzybów zostały złożone w zielniku mykologicznym University of Tras-os-Montes e Alto Douro. Frakcje polisacharydowe BE 1-4 i CC 1-6 zostały otrzymane i przygotowane do analiz biologicznych w Chemistry Department, University of Tras-os-Montes e Alto Douro, Vila Real (Portugalia).

Liofilizowane grzyby Boletus edulis i Cantharellus cibarius ekstrahowano wrzącym 80% etanolu, w celu eliminacji związków niskocząsteczkowych nierozpuszczalnych w alkoholu. Następnie mieszaniny ekstrahowano gorącą wodą i dializowano (punkt odcięcia 10-15 kDa), co pozwoliło na uzyskanie rozpuszczalnych w wodzie frakcji bogatych w związki wysokocząsteczkowe w tym w polisacharydy. W celu oddzielenia polisacharydów obojętnych od glikoprotein, uzyskane frakcje poddano oczyszczaniu za pomocą chromatografii jonowymiennej na kolumnach XK16/20 (szerokość 1,6 cm, długość 20 cm) (Pharmacia) wypełnionych Q-Sepharose FF, jako eluentu użyto buforowanego roztworu octanu sodu 5 mM, pH 4,5 zawierającego 0,02% azydek sodu. W pierwszym etapie frakcje WSM (1 mg/ml) zostały naniesione na kolumnę, po czym kolumna został przemyta buforem startowym w ilości odpowiadającej 4 krotnej objętości kolumny lub w ilości przy której mierzona przy długości fali 280 nm absorbancja osiągnęła poziom startowy. Zatrzymane na kolumnie substancje były wymywane w warunkach elucji gradientowej z zastosowaniem coraz to bardziej stężonych roztworów NaCl: 0-500 mM NaCl przez 5 h, 500-1000 mM NaCl 3 h, 1000-2000 mM NaCl 2 h. W trakcie elucji zbierano frakcje (po 2 ml), w których oznaczano całkowitą zawartość cukrów metodą fenol-kwas siarkowy oraz odczytano absorbancję przy długości fali 280 nm (białko). Następnie odpowiednie frakcje zostały połączone i poddane dializie (punkt odcięcia 12-14 kDa), po czym zostały on zliofilizowane. Otrzymano 5 frakcji polisacharydowych z Cantharellus cibarius (oznaczone jako CC1-6) oraz cztery frakcje z Boletus edulis (oznaczone jako BE1-4). Celem określenia struktury pierwszorzędowej polisacharydów obecnych w badanej frakcji, poddano je kwaśnej hydrolizie. W tym celu 2-5 mg zliofilizowanej próbki zawieszono w 1 M kwasie siarkowym i utrzymywano w stanie wrzenia przez 2.5 h. Po hydrolizie do roztworu dodane 0.5 ml 2-deoksyglukozy (lmg/ml) jako standard wewnętrzny. Następnie roztwór rozcieńczono 10 krotnie i poddano właściwemu oznaczeniu z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii jonowej z pulsacyjną detekcją amperometryczną HPLC-PAD. Oznaczenie wykonano na aparacie ICS-300 (Dionex), z wykorzystaniem kolumn CarboPac PA-20 zaopatrzonych w prekolumny CarboPac PA20. Jako eluent wykorzystano 5 mM roztwór NaOH zawierający 2 mM Ba(OH)2