3110399252

Poniższe opracowanie stanowi materiał uzupełniający do ćwiczenia 10 realizowanego na zajęciach dydaktycznych „Biochemia - laboratorium" przeznaczonych dla studentów Wydziału Chemicznego Politechniki Warszawskiej, kierunek Biotechnologia (stopień studiów 1; semestr 4).

Ćwiczenie 10

METODY IZOLOWANIA I ROZDZIAŁU KWASÓW NUKLEINOWYCH

1. Metody izolacji DNA z materiału biologicznego

Celem metod preparatywnych wykorzystywanych do ilościowego izolowania DNA z materiału biologicznego pochodzącego z różnych źródeł (komórki mikroorganizmów, komórki/tkanki roślinne i zwierzęce) jest uzyskiwanie preparatów czystych pod względem chemicznym, charakteryzujących się możliwie jak najmniejszym stopniem uszkodzenia struktury kwasu deoksyrybonukleinowego. Uwzględniając uogólniony skład chemiczny komórek różnych typów, preparaty DNA mogą być zanieczyszczone białkowymi elementami jąder komórkowych oraz kwasami rybonukleinowymi. Zatem metody izolacji i oczyszczania DNA muszą skupiać się na rozdzieleniu tych składników komórek i usunięciu ich z poddawanego ekstrakcji homogenatu komórkowego w postaci frakcji zawierających dane składniki. Podczas preparatywnego oczyszczania DNA należy zwrócić szczególną uwagę na ograniczenie, czy wręcz wyeliminowanie katalitycznego działania wewnątrzkomórkowych deoksyrybonukleaz. Najczęściej, w tkankach pobranych celem wydzielenia z nich DNA mamy do czynienia z zaburzeniami systemów regulacji metabolizmu komórek i ich homeostazy, które to nieprawidłowości nasilają się od momentu pobrania danego fragmentu tkanki roślinnej czy zwierzęcej w formie eksplantatu czy eksplantu. W wyniki zaburzeń przemian metabolicznych, nukleazy katalizują hydrolityczny rozkład natywnego DNA komórki, czym wywołują jego stopniową degradację. Na wydajność preparatyki DNA z danego typu komórek czy też tkanki wpływ mają ich własności. Najbardziej istotny wpływ wywierają aktywność wewnątrzkomórkowych enzymów nukleotydo- i nukleozydolitycznych, ilościowy stosunek RNA/DNA oraz zawartość DNA w poddawanym obróbce materiale biologicznym. W przypadku przykładowych tkanek zwierzęcych wysoka aktywność nukleaz charakteryzuje śledzionę oraz trzustkę, natomiast niska grasicę; stosunek RNA/DNA może wynosić około 4 dla komórek wątroby szczura i być około dziesięciokrotnie niższy w komórkach grasicy cielęcej; zawartość DNA w komórkach również może wahać się w szerokim zakresie od np. 0,2 % w wątrobie szczura do ponad 2,5 % w grasicy cielęcej.

Znanych jest wiele metod wyodrębniania frakcji kwasów deoksy- oraz rybonukleinowych (DNA i RNA). W odniesieniu do tkanek pochodzenia zwierzęcego najbardziej rozpowszechnionymi są metody Schmidta i Thannhausera (1945 r.) oraz Schneidera (1945 r.) a także liczne warianty metodyki Marmura opracowanej pierwotnie (1961 r.) na potrzeby izolacji DNA z komórek mikroorganizmów. Zarówno w metodzie odnoszącej się do tkanek roślinnych jak i w większości technik stosowanych w przypadku zwierzęcego materiału biologicznego (metody Schmidta i Thannhausera oraz Schneidera) pierwsze etapy izolacji kwasów nukleinowych sprowadzają się do ekstrakcji z homogenizowanej tkanki związków fosforowych rozpuszczalnych w kwasach (np. nadchlorowym, trichlorooctowym). Pozwala to wydzielić z homogenatu związki niskocząsteczkowe, np. nukleotydy o różnym stopniu ufosforylowania, cukrowce (estry heksozo- i triozofosforanowe), fosfoenolopirogronian, acetylofosforan, orto-, meta- i pirofosforany nieorganiczne. Kolejnym etapem wspomnianych metod jest ekstrakcja frakcji tłuszczowej (głównie w postaci fosfolipidów) z wykorzystaniem etanolu lub mieszanin etanolu i chloroformu bądź wybranego eteru. Uzyskane frakcje składników komórkowych

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia