3725451922

niektórych chorobach, np. w brucelozie powstają przeciwciała niekompletne, które można wykryć pośrednim odczynem Coombsa.

Metody oparte o zjawisko precypitacii

Metody te oparte są o zasadę, że tzw. antygeny rozpuszczalne (białka, polisacharydy, glikoproteiny..) łączą się z wolnym przeciwciałem i tworzą agregaty/strąt/precypitat. W zależności stężenia antygenu i przeciwciał powstają większe lub mniejsze kompleksy antygen-przeciwciało. Wpływa to na intensywność reakcji -największe kompleksy powstają w tzw. strefie równowagi. Ma to istotne znaczenie również w organizmie, kiedy dochodzić może do odkładania się kompleksów w tkankach i niekorzystnych reakcji zapalnych. *precvpitacja pierścieniowa - wyłącznie jakościowy odczyn, na surowicę zawierającą przeciwciała nawarstwia się delikatnie antygen lub odwrotnie. W miejscu zetknięcia się i równowagi (strefa ekwiwalencji) powstaje pierścień precypitacyjny.

Studenci wykonują delikatnie precypitację pierścieniową, wykrywają w roztworze obecność np. toksyny jadu kiełbasianego

*podwóina dyfuzją (immunodyfuział w żelu - metoda Outcherlony,ego, jakościowa. W agarze wycina się studzienki, do których odpowiednio nanosi się roztwór antygenu i przeciwciał, które dyfundują w agarze. Po inkubacji powstająłuki precypitacyjne.

Studenci oglądają wykrywanie przeciwciał dła kwasów tejchojowych(antygen) w badanych próbkach surowicy

*immunodvfiizia radialna Mancini.ego- można oznaczyć niewielkie ilości antygenu. Używa się płytek, pokrytych agarem zmieszanym z przeciwciałami. Do wyciętych studzienek dodaje się surowicę/płyn w którym szuka się antygenu. Kompleksy antygen przeciwciało tworzą w zależności od ilości antygenu, różnej średnicy pierścienie precypitacyjne. Stężenie antygenu obliczamy z krzywej standardowej dla antygenów wzorcowych. Tą metodą oznacza się stężenia immunoglobulin ludzkich, składników dopełniacza, inne białka.

Studenci oceniają poziom immunoglobulin w surowicy

*immunoelektroforeza - jest połączeniem elektroforezy i immunodyfuzji. Służy do oceny białek surowicy. Mieszaninę białek, np. surowicy krwi rozdziela się w elektroforezie, następnie dodaje surowicy odpornościowej. Przeciwciała dyfundują w żelu i tworzą łuki precypitacyjne o odpowiednim kształcie i grubości. Brak niektórych linii świadczy o niedoborze, linie pogrubiałe o nadprodukcji, np. w szpiczaku. Przy zastosowaniu wybiórczych przeciwciał można oznaczać obecność pojedynczych białek.

Studenci oglądają immunoelektroforezę białek surowicy krwi

* immunoelektroforeza rakietkowa - elektroforezę antygenu prowadzi się w żelu zawierającym stałe stężenie przeciwciała. Kompleksy antygen-przeciwciało tworzą w strefie ekwiwalencji linie precypitacyjne przypominające kształtem rakietki. Wysokość rakietki jest wprost proporcjonalna do stężenia antygenu. Studenci oglądają wykrywanie białek układu krzepnięcia metodą imm. rakietkowej.

Złożone techniki serologiczne

Do oceny reakcji antygen przeciwciało wymagane są dodatkowe czynniki-znaczniki immunodetekcji, systemy wykrywające czy specjalistyczna aparatura.

*odczvn lizy - wykorzystuje zdolność wiązania dopełniacza przez kompleks antygen-przeciwciało i doprowadzenie do lizy (uszkodzenia) antygenu.

Studenci wykonują odczyn lityczny: do dwóch probówek dają: 2 krople 5% krwinek barana lub krwinek ludzkich, dodają 4 krople surowicy z przeciwciałami, (tworzy się aglutynacja), następnie dodają 6 kropli dopełniacza i inkubują w temp. ciała (ktoś trzyma w ręku). Liza występuje w układzie homologicznym. *odczvn wiązania dopełniacza (OWDf- wykorzystuje się zdolność dopełniacza do lizy kompleksu: krwinka czerwona + swoiste przeciwciało. Odczyn jest dwustopniowy i zawiera układ testujący: surowica badana pozbawiona własnego dopełniacza (podgrzana wcześniej do temp. 56° C) + antygen + dopełniacz, inkubacja, następnie dodaje się system wykrywający: krwinki czerwone owcy + przeciwciała swoiste (amboceptor króliczy). Brak hemolizy świadczy o obecności poszukiwanych przeciwciał - odczyn dodatni, obecność hemolizy - odczyn ujemny. Prawidłowe wykonanie odczynu wymaga odpowiednich kontroli i precyzyjnej standaryzacji. Do niedawna był stosowany w diagnostyce kiły jako tzw. odczyn Wassermana (jakościowy) lub Kolmera (ilościowy)

Studenci oglądają schemat wykonania odczynu Wassermana.

*odczynv immunofluorescencyjne - wykorzystuje się znaczniki fluorescencyjne (np. izotiocjanian fluoresceiny) widoczne w mikroskopie fluorescencyjnym. Można znakować antygen lub przeciwciało -odczyn bezpośredni lub do kompleksu antygen-przeciwciało dodawać znakowanej surowicy antyglobulinowej - odczyn pośredni. Odczyny bezpośrednie częściej stosuje się szeroko do wykrycia antygenów bakteryjnych (Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae..) i wirusowych (wirus wścieklizny, grypy, paragrypy...) w komórkach