3870137257

52 Z GDANIEC

nywana była albo na naturalnej zawartości izotopu ^{1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13}C lub stosując specyficznie ¹⁴N i/lub ¹²C znakowane oligonukleotydy otrzymywane metodami syntezy' chemicznej. Do tej pory zaproponowano dwie fundamentalnie różne strategie enzymatycznej syntezy znakowanych izotopowo cząsteczek DNA. Pierwsze z tych podejść wykorzystuje dupleksy DNA z mesparowanym, jednoniciowym końcem służącym jako matryca dla syntezy komplementarnej nici o wymaganej sekwencji [5J. Dotychczas dla syntezy znakowanych DNA zaproponowano dwie różne polimerazy: polimerazę DNAI [5,14] i polimerazę Taq [15]. Drugie podejście polega na amplifikacji metodą PCR tandemowych powtórzeń wybranych sekwencji [4,6], Wadą tej metody jest to, że produktem reakcji jest dupleks (> 25 par zasad), składający się z dwóch nici jednakowej długości.

Niezwykle wysokie koszty syntezy chemicznej cząsteczek RNA całkowicie znakowanych izotopowo (¹²C/¹⁴N) sprawiają, że synteza enzymatyczna jest obecnie metodą z wyboru. Natomiast selektywne znakwanie wybranych atomów węgla i azotu w cząsteczce można otrzymać jedynie na drodze syntezy chemicznej. Podejście to rozwijane jest w naszej Pracowni.

Znakowane izotopami ¹²C i/lub ¹⁴N fosforynoamidy DNA są dostępne handlowo i chociaż również bardzo kosztowna, synteza chemiczna całkowicie znakowanych izotopowo cząsteczek DNA jest obecnie możliwa

1

PARAMETRY STRUKTURALNE KWASÓW NUKLEINOWYCH

2

Konformację cząsteczek DNA i RNA można jednoznacznie określić przez

3

wyznaczenie dla każdej jednostki nukleotydowej sześciu kątów torsyjnych szkieletu

4

fosforocukrowego, kąta//-glikozydowego definiującego względne położenie zasady

5

i reszty' cukrowej (Rysunek IB), oraz kąta fazowego pseudorotacji określającego

6

konformację pierścienia cukrowego. W strukturze podwójnej helisy B-DNA deoksy-

7

ryboza przyjmuje konformację C2'-endo, natomiast typową konformacją rybozy

8

■v helikalnych strukturach A-RNAjest forma C3 ’-endo (Rysunek 1C).

9

Podstawowym źródłem informacji w ustalaniu struktury biomolckuł metodami

10

spektroskopii NMR są więzy odległościowe otrzymane na podstawie wielkości efek

11

tu NOE, oraz sprzężenia skalarne, których analiza dostarcza więzów dla kątów tor

12

syjnych. Znajomość jak największej liczby kontaktów NOE oraz sprzężeń skalarnych

13

pozwala na wyznaczenie struktury cząsteczki z większą dokładnością i precyzją.

14

Z uwagi na dużo mniejszą liczbę strukturalnie istotnych więzów NOE, więzy kątowe otrzymane na podstawie analizy' sprzężeń stanowią dla kwasów nukleinowych dużo cenniejsze źródło dodatkowych informacji niż ma to miejsce w analizie białek. Skalarne stałe sprzężenia dostarczają również informacji o istnieniu różnych form konfor-macyjnych będących w równowadze oraz o ich populacji.