5192605670

42 A. KOZIK [10]

lumny roztworami o różnym stężeniu ligandu rozpuszczalnego strefowym wymywaniu białka. Wyniki pomiarów analizuje się według równania (74):

___1_ _    1    K [L]

V - V₀ ' (V₀ - V_P)K [L] ⁺ (V₀ - V_P)K [L] (^{rownanie 1} °)

Jest ono analogiczne do równania 9 z f = 1 i K [B]    1. Ostatnie założe

nie warunkuje szczególną zaletę techniki strefowego wymywania kom-petycyjnego — konieczność zużywania minimalnej ilości białka. Tylko czułość detekcji białka w wycieku może być pod tym względem czynnikiem ograniczającym. Inna zaleta to możliwość ilościowego badania słabych oddziaływań tj. przypadku, dla którego wiele klasycznych metod (np. dializa równowagowa) daje wyniki obarczone dużymi błędami. Najniższe wartości K, wyznaczone przy zastosowaniu strefowego wymywania kompetycyjnego są rzędu 100 M^-1 (75).

Omawianą technikę zastosowano do wyznaczania stałych K i K dla oddziaływania różnych ligandów z nukleazą ze Staphylococcus (74, 76), rybonukleazą (75, 77, 78), chymotrypsyną (79), trypsyną (80, 81), karbo-ksypeptydazą B (68) oraz fragmentem Fab immunoglobuliny A (82 a). Zmodyfikowany wariant metodyczny wykorzystano do oszacowania stałej K dla układu AMP-dehydrogenaza mleczanowa (83). Dla tego samego układu opracowano inną modyfikację (84), polegającą na wymywaniu w gradiencie stężenia rozpuszczalnego ligandu. Stałą K dla badanego ligandu odczytywano z krzywej kalibracyjnej, sporządzonej dla szeregu ligandów o znanych wartościach K.

Ograniczeniem metody kompetycyjnego wymywania strefowego jest trudność oszacowania efektywnego stężenia unieruchomionego ligandu a co za tym idzie — niepewność oznaczenia stałej K. Największą jednak wadą jest zawężenie zakresu zastosowań głównie do białek monowalen-cyjnych. Próby jej adaptacji do układów poliwalencyjnych (n!>l) podjęto dla kompleksów immunoglobulina A-fosfocholina (82 a, b) oraz kon-kanawalina A-cukry (85). Wyprowadzone równania nie mają charakteru ogólnego, a ponadto są skomplikowane i można je analizować wyłącznie metodami numerycznymi.

Uproszczony sposób traktowania układów poliwalencyjnych (86) polega na użyciu żelu o bardzo niskiej zawartości ligandu unieruchomionego. W tych warunkach jedna cząsteczka białka nie może jednocześnie wiązać dwóch cząsteczek unieruchomionego ligandu. Układ zachowuje się przeto jak monowalencyjny, co pozwala na zastosowanie równania 10.

W przypadku wyższych stężeń ligandu unieruchomionego, wiązanie z białkiem poliwalencyjnym może wykazywać efekty kooperatywności, uwarunkowanej czynnikami sterycznymi. Ostatnio przedstawiono teoretyczną analizę tego zjawiska (87).