5192605736

19] 61 BIAŁKO WIĄŻĄCE WITAMINĘ D

ka 4S do DBP. Kompleks ten charakteryzuje się wysokim»powinowactwem, wyrażonym przez stałą asocjacji K_A = 1,8X10⁷M^-1. Wysycenie DBP przez ligandy sterolowe nie miało wpływu na wartość K_A, jak również na pojemność wiązania składnika cytosolowego (35).

Ponieważ masa cząsteczkowa całego kompleksu, oznaczona metodą filtrowania na żelu (27) ma wartość 98 000, a komponentów 58 000 i 39 000, stosunek cząsteczkowy między tymi komponentami wynosi 1:1.

Kompleksowy charakter cytosolowego białka wiążącego 25 OHD₃ o stałej sedymentacji 5-6S, potwierdziła jego dysocjacja po ogrzaniu cyto-solu do 60°C. W tych warunkach zaobserwowano uwalnianie białka charakterystycznego dla krwi, o stałej sedymentacji 3,4-4,2S. Składnik cyto-solowy wrażliwy na ogrzewanie ulegał najprawdopodobniej denaturacji cieplnej (39).

W wielu laboratoriach (35, 37, 39) badano powstawanie kompleksu 5-6S in vitro. Surowicę znakowaną 25 OH[³H]D₃ inkubowano z cytoso-lem jelita szczura (36, 37) lub cytosolem ludzkich mięśni szkieletowych (35). Jak ustalono, dodana w postaci znakowanego 25 OHD₃ radioaktywność, występowała we frakcji o stałej sedymentacji 5-6S, charakterystycznej dla cytosolowego białka wiążącego (35, 37, 39). Stwierdzono również, że łączenie DBP z krwi ze składnikiem cytosolowym 4S, jest procesem wysycalnym. Wraz ze wzrostem ilości dodawanego cyto-solu, zwiększała się ilość kompleksu 5-6S (39). Na uwagę zasługuje fakt, że kompleks powstawał także podczas inkubacji cytosolu tkanek szczura i ludzkiej surowicy, co przemawia za brakiem specyficzności gatunkowej.

Biorąc pod uwagę wszystkie powyższe dane nasuwa się pytanie, czy białko cytosolowe 5-6S wiążące 25 OHD₃ ma znaczenie fizjologiczne, czy też jest artefaktem powstałym podczas preparowania cytosolu, wynikającym z zanieczyszczenia surowicą. Potwierdzenia niefizjologicznego powstawania kompleksu można znaleźć w pracach Kream i Van B a e 1 e n (37, 39). W izolowanych komórkach jelitowych przemywanych buforem autorzy ci nie obserwowali obecności cytosolowego białka 5-6S. Natomiast kiedy komórki homogenizowano z dodatkiem surowicy lub do otrzymanego cytosolu dodawano surowicę, białko pojawiało się (37). Podobnie, w cytosolu pochodzącym z komórek hodowli tkankowej nerek szczura, nerek ludzkich i fibroblastów skóry ludzkiej, nie znaleziono kompleksu 5-6S, natomiast występowało białko kompleksujące 4S (39). Jednakże sam fakt, że białko wiążące kompleks 5-6S nie pojawia się w kulturach komórkowych bez surowicy, nie jest jeszcze argumentem przeciwko jego występowaniu in vivo, zważywszy, że w opisanych warunkach może zachodzić uwarunkowana fizjologicznie konieczność wnikania białka wiążącego witaminę D z krwi (DBP) do komórki.

Za występowaniem białka 5-6S in vivo przemawia fakt, że kompleks powstaje w fizjologicznym pH 7,4 i 9,0 (27), natomiast do swej dysocjacji