5783290846

Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego „RP/NP-HPLC-r

Wysokosprawna elucyjna, kolumnowa chromatografia cieczowa w układzie faz normalnych (NP-HPLC) i odwróconych (RP-HPLC)

- podstawowe zależności i zasady -

WSTĘP

Chromatografia jest przede wszystkim techniką rozdzielania substancji. Po zastosowaniu detektora, spełniającego rolę przepływowego instrumentu pomiarowego staje się techniką analityczną.

Oznaczanie zawartości substancji w mieszaninie jest często trudne, albo niemożliwe, a po ich rozdzieleniu problem analityczny z reguły staje się zasadniczo prostszy.

Szczególna zaletą chromatografii cieczowej jest ogromnie szeroki zakres uniwersalności tej techniki rozdzielania. Można ją zastosować do analizy mieszanin prawie wszystkich substancji, zarówno lotnych, jak i nielotnych, trwałych i nietrwałych termicznie itd., pod warunkiem istnienia jakiegokolwiek ich rozpuszczalnika. W nowoczesnym wykonaniu jest techniką rozdzielania, zarówno o wysokiej sprawności (wysoka liczba półek teoretycznych kolumny), jak i o szczególnie wysokiej selektywności, która to, jest uzyskiwana dzięki wykorzystywaniu konkurencyjnych oddziaływań między cząsteczkami rozdzielanych substancji i cząsteczkami eluentu a powierzchnią sorpcyjną fazy stacjonarnej. Często wpływ na selektywność rozdzielania mają też oddziaływania miedzy cząsteczkami rozdzielanych substancji i cząsteczkami eluentu (solwatacja, cofanie dysocjacji, tworzenie tzw. par jonowych itp.).

Dysponujemy współcześnie bardzo dużą liczbą różnego rodzaju faz stacjonarnych oraz bardzo czułymi detektorami, o korzystnej charakterystyce pomiarowej i dynamice odpowiedzi oraz oprogramowaniami komputerowymi, zapewniającymi możliwość automatycznego sterowania modułami aparatu i wykonania w sposób dokładny i precyzyjny oznaczeń ilościowych.

Niektóre z detektorów umożliwiają też wykonanie identyfikacji jakościowej z wysokim poziomem ufności rezultatu (LC-MS, UV-DAD, LC-NMR).

W celu wykonania oznaczeń ilościowych, stosuje się metodę krzywej kalibracyjnej, metodę wzorca wewnętrznego, albo metodę normalizacji, czy dodatku wzorca.

CEL ĆWICZENIA

1)    Poznanie odstawowych pojęć i zależności opisujących retencję substancji, selektywność oraz sprawność kolumny i układu chromatograficznego w warunkach HPLC oraz najważniejsze wzajemne relacje i zależności funkcyjne między tymi wielkościami,

2)    Zasady postępowania dla doboru optymalnych warunków rozdzielania, identyfikacji, detekcji i oznaczania zawartości substancji z zastosowaniem wysokosprawnej kolumnowej, elucyjnej chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych (NP-HPLC) oraz faz odwróconych (RP-HPLC) z detekcją UV-VIS / DAD, RID, FLD. Budowa i zasady działania aparatury HPLC różnego typu.

OGÓLNE ZASADY WYKONANIA ĆWICZENIA i SPRAWOZDANIA

- Studenci powinni być przygotowani w zakresie znajomości najważniejszych pojęć związanych z chromatografią i z chromatografią cieczową, w szczególności.

Znaczenie i zrozumienie pojąć oraz parametrów opisujących sorbent, eluenl, kolumną, wypełnienie kolumny, retencją substancji, selektywność i rozdzielczość układu chromatograficznego oraz kolumny; Podstawowe mechanizmy fizykochemiczne decydujące o retencji substancji i selektywności adsorpcyjnych, podziałowych, jonowymiennych i żelowych układów chromatograficznych; Zasady doboru eluentu i warunki jakie powinien spełniać eluent; Pojącie sprawności kolumny i zjawiska decydujące o sprawności (o wysokości równoważnej półce teoretycznej); Sposób wyznaczania (obliczania) - współczynnika retencji, selektywności układu chromatograficznego, współczynnika rozdzielenia (rozdzielczości), objątości martwej (czasu martwego), sprawności kolumny (wysokości równoważnej półce teoretycznej / liczby pólek teoretycznych); Zasada budowy i działania aparatu HPLC i jego głównych modułów (pompa, dozownik, kolumna, system programowania składu eluentu, detektor, system rejestracji i przetwarzania danych pomiarowych); Podstawowe rodzaje detektorów

3