Biochemia: Ćw. 8 - Lipidy
Ćwiczenie 8 LIPIDY
WyciÄ…g z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:
bezwodnik kwasu octowego  C,
bromek jodu  C,
chlorek baru  T,
chlorek wapnia  Xi,
chloroform  Xn,
etanol 96%  F,
kwas octowy lodowaty  C
kwas siarkowy  C,
siarczan miedzi (II)  Xn, N,
węglan sodu  X,
woda bromowa  C, N, Tn,
wodorosiarczan potasu  C,
wodorotlenek potasu  C,
wodorotlenek sodu  C
1. WYKRYWANIE GLICEROLU
1.1. PRÓBA AKROLEINOWA
Produktami reakcji hydrolizy tłuszczów właściwych (kwasowej, zasadowej lub enzymatycznej z udziałem lipaz) są: glicerol i odpowiednie
kwasy tłuszczowe. Glicerol (propanotriol, nazwa zwyczajowa  gliceryna) ulega odwodnieniu w wysokiej temperaturze w obecności
czynników odciągających wodę (np. KHSO ). W wyniku tej reakcji powstaje nienasycony aldehyd kwasu akrylowego zwany akroleiną,
4
zgodnie z równaniem:
glicerol akroleina
Wykonanie: Przygotować krótką szklaną probówkę  suchą (!). Kilka kropli glicerolu ogrzać (nad palnikiem) w probówce z ok.
0.2 g krystalicznego KHS0 . WydzielajÄ… siÄ™ dymy akroleiny o dra\
niącym zapachu. U wylotu probówki umieścić pasek bibuły
4
zwil\
ony roztworem wodorotlenku diamoniakalno-srebrowego, który ciemnieje, wskutek redukujących właściwości akroleiny.
1.2. REAKCJA Z WODOROTLENKIEM MIEDZI
Glicerol będąc alkoholem trihydroksylowym tworzy z Cu(OH) połączenia kompleksowe o intensywnym niebieskim zabarwieniu.
2
Wykonanie: Przygotować krótką probówkę szklaną. Do 0.5 ml nasyconego roztworu CuSO dodać kroplami 2M roztwór
4
NaOH, a\
do wytrącenia się niebieskiego osadu Cu(OH) . Po dodaniu kilku kropli glicerolu osad rozpuszcza się, a roztwór
2
przyjmuje intensywnÄ… niebieskÄ… barwÄ™.
2.1. ROZPUSZCZALNOŚĆ TA
USZCZÓW
Tłuszcze nie rozpuszczają się w wodzie. Ulegają emulgacji przy zmniejszonym napięciu powierzchniowym przez detergent. W etanolu
tłuszcze rozpuszczają się słabo. Bardzo dobrze rozpuszczają się w chloroformie.
Wykonanie: Przygotować cztery probówki szklane. Do ka\
dej z nich dodać 3  4 krople oleju roślinnego. Następnie do
pierwszej wlać 1 ml wody destylowanej, do drugiej  1 ml detergentu rozcieńczonego 4-krotnie wodą destylowaną, do
trzeciej  1 ml etanolu a do czwartej  1 ml chloroformu. Zawartość probówek wymieszać dokładnie na wortexie.
Obserwować rozpuszczalność tłuszczu.
1
Biochemia: Ćw. 8 - Lipidy
2.2. ROZPUSZCZALNOŚĆ BARWNIKÓW W TA
USZCZACH
Sudan III to czerwony barwnik disazowy rozpuszczalny w benzenie, acetonie i etanolu Długi, niepolarny łańcuch węglowodorowy
wchodzący w skład tego barwnika, sprawia, \
e związek ten dobrze rozpuszcza się w tłuszczach.
Sudan III
Wykonanie: Przygotować jedną krótką probówkę. Dodać 2 ml wody destylowanej i odrobinę (!) barwnika Sudan III  barwnik
nie rozpuszcza się w wodzie. Następnie dodać 0.5 ml oleju i zamieszać zawartość probówki  barwnik rozpuszcza się w
oleju.
3. ZMYDLANIE TA
USZCZÓW
Hydroliza zasadowa (np. z udziałem wodorotlenku sodu lub potasu) prowadzi do powstania gliceryny oraz soli kwasów organicznych, czyli
mydeł, dlatego nazywana jest zmydlaniem tłuszczu. Reakcja ta wykorzystywana jest przy produkcji mydła.
3.1. OTRZYMYWANIE MYDA
A
Wykonanie: W porcelanowej parownicy rozgrzać na kuchence elektrycznej ok. 1 g smalcu. Do gorącego smalcu dodać 1.6
ml 30% NaOH, a następnie 1 ml etanolu. Mieszając tłuczkiem, ogrzewać do utworzenia się jednolitej masy mydła. Dodając
stopniowo gorącą wodę (ok. 150 ml), przelać roztwór mydła do zlewki o objętości 250 ml i kontynuować ogrzewanie, ciągle
mieszajÄ…c bagietkÄ…, a\
do całkowitego rozpuszczenia się mydła.
3.2. OTRZYMYWANIE MYDA
A NIEROZPUSZCZALNEGO
Wykonanie: Przygotować trzy krótkie probówki. Do ka\
dej z nich dodać po 2 ml roztworu mydła a następnie do pierwszej 
0.5 ml 1% roztworu CaCl , od drugiej  0.5 ml 1% roztworu BaCl . Trzecią pozostawić jako próbę kontrolną do porównania.
2 2
W probówce z chlorkami: wapnia i baru wytrąca się osad nierozpuszczalnych mydeł wapniowych i barowych.
3.3. WYSALANIE MYDA
A
Wykonanie: Do probówki z 5 ml roztworu mydła wprowadzać porcjami NaCl in substantia, a\
do wysycenia roztworu.
Wytrąca się kłaczkowaty osad mydła, który rozpuszcza się po dodaniu wody w nadmiarze.
3.4. TWORZENIE TRWAA
EJ EMULSJI TA
USZCZU W OBECNOÅšCI MYDA
A
Wykonanie: Przygotować dwie krótkie probówki. Do pierwszej probówki dodać 4 ml wody destylowanej i 0.5 ml oleju a do
drugiej 4 ml roztworu mydła, 0.5 ml oleju oraz odrobinę Sudanu III. Zawartość probówek silnie wstrząsnąć. W probówce z
mydłem wytwarza się trwała emulsja.
Porównać wynik uzyskane w doświadczeniu 2.1 (rozpuszczalność tłuszczu w roztworze detergentu), 2.2 oraz 3.4. Wyciągnąć wnioski.
2
Biochemia: Ćw. 8 - Lipidy
4. ROZRÓśNIANIE MIEDZY NASYCONYMI I NIENASYCONYMI KWASAMI TA
USZCZOWYMI
4.1. REAKCJA ADDYCJI BROMU
Tłuszcze roślinne i zwierzęce ró\
nią się rodzajem kwasów tłuszczowych, którymi zestryfikowany jest glicerol. Tłuszcze roślinne są
związkami nienasyconymi, a więc estrami gliceryny i nienasyconych kwasów karboksylowych, natomiast tłuszcze zwierzęce to związki
nasycone  estry gliceryny i nasyconych kwasów karboksylowych. Aby odró\
nić tłuszcz roślinny od zwierzęcego mo\
na u\
yć wody
bromowej (nasycony, wodny roztwór bromu o intensywnie \
ółtej barwie). Reakcja przyłączania chlorowców pozwala na wykrycie
obecności nienasyconych wiązań oraz jest podstawą ich ilościowego oznaczania (oznaczanie liczby jodowej). Tłuszcze roślinne
zawierające wiązania podwójne przyłączając brom powodują odbarwienie wody bromowej.
Wykonanie: Przygotować 3 krótkie i 3 długie szklane probówki. Nad palnikiem roztopić niewielką ilość masła zwierzęcego w
pierwszej krótkiej szklanej probówce. Do drugiej krótkiej probówki dodać 0.3 ml stopionego masła a do trzeciej 0.3 ml oleju
roślinnego. Do drugiej i trzeciej probówki dodać po 3 ml etanolu; rozmieszać dokładnie zawartość obu probówek.
Do trzech długich probówek odmierzyć po 2 ml wody bromowej pod dygestorium (!). Do pierwszej dodać 1 ml etanolu (próba
kontrolna), do drugiej  1 ml masła zwierzęcego w etanolu a do trzeciej  1 ml oleju roślinnego w etanolu. Po wymieszaniu
obserwować zmianę barwy roztworu pod wpływem obydwu rodzajów tłuszczów.
4.2. REAKCJA Z MANGANIANEM (VII) POTASU
Wykonanie: Przygotować 2 krótkie szklane probówki. Po pierwszej dodać 0.2 ml oleju, do drugiej 0.2 ml stopionego masła (z
dośw. 4.1) a następnie do obydwu po 1 ml roztworu Na CO . Lekko ogrzać nad palnikiem i wstrząsając, dodawać stopniowo
2 3
świe\
o przygotowany roztwór KMnO * (ok. 1 ml). W probówce z olejem roztwór manganianu (VII) potasu początkowo
4
odbarwia się, a następnie zaczyna wydzielać się brunatny osad MnO . Je\
eli osad jest słabo widoczny, roztwór przenieść do
2
probówki wirowniczej o obj. 2 ml i zwirować. Zwirować równie\
roztwór zawierający masło.
* kryształek KMnO rozpuścić w niewielkiej objętości wody destylowanej, zamieszać
4
5.1. ANALIZA JAKOÅšCIOWA CHOLESTEROLU
Cholesterol to nienasycony jednowodorotlenowy alkohol zaliczany do endogennych steroli zwierzęcych. Wchodząc w skład błon
organizmów eukariotycznych modulując ich płynność. Jest równie\
prekursorem hormonów steroidowych (progesteron, testosteron,
estradiol, kortyzon).
5.1.1. PRÓBA SALKOWSKIEGO
StÄ™\
ony kwas siarkowy powoduje odłączenie od cholesterolu cząsteczki wody, w wyniku czego powstaje kwas disulfonowy
bicholestadienu barwiÄ…cy warstwÄ™ chloroformowÄ… na kolor malinowy.
Wykonanie: Przygotować dwie krótkie szklane probówki  suche (!). Do pierwszej dodać 1 ml 0.2% chloroformowego
roztworu cholesterolu, do drugiej  1 ml stopionego masła w chloroformie (0.3 ml masła + 0.7 ml chloroformu), podwarstwić
kilkoma kroplami stÄ™\
. H SO . Warstwa chloroformowa barwi siÄ™ na kolor malinowy, natomiast dolna warstwa wykazuje
2 4
zieloną fluorescencję. Jeśli zmiana koloru nie zajdzie od razu po dodaniu H SO , probówkę odstawić na kilkanaście minut.
2 4
3
Biochemia: Ćw. 8 - Lipidy
5.1.2. PRÓBA LIEBERMANA I BURCHARDA
W obecności kwasu siarkowego i bezwodnika kwasu octowego z cholesterolu powstaje kwas monosulfonowy bicholestadienu barwiący
roztwór na kolor zielony.
Wykonanie: Przygotować krótkie probówki szklane  suche (!). Do jednej dodać 1 ml 0.2% chloroformowego roztworu
cholesterolu a do drugiej 1 ml masła rozpuszczonego w chloroformie (0.3 ml masła + 0.7 ml chloroformu). Do obu probówek
dodać 0.5 ml bezwodnika kwasu octowego a następnie ostro\
nie po ściankach obu probówek po 2 krople stę\
. H SO .
2 4
Roztwór zabarwia się na zielono.
5.1.3. REAKCJA WINDAUSA
Wykonanie: Przygotować krótką szklaną probówkę. Do 1 ml chloroformowego roztworu cholesterolu dodawać 4  5 kropli
odczynnika Hanusa (roztwór IBr w lodowatym kwasie octowym). Powstają kryształki 5,6-dibromocholesterolu  po
zamieszaniu obserwować na ściankach probówki. Reakcja ta pozwala wykazać obecność podwójnego wiązania w
czÄ…steczce cholesterolu.
5.2. ANALIZA ILOÅšCIOWA CHOLESTEROLU
Wykonanie:
Przygotowanie krzywej kalibracyjnej. Przygotować sześć probówek ze szklanym korkiem. Do pięciu odmierzyć kolejno 1,
2, 3, 4 i 5 ml 0.02% chloroformowego roztworu cholesterolu a następnie dopełnić do objętości 5 ml chloroformem, do szóstej
probówki dodać 5 ml chloroformu (ślepa odczynnikowa). Do wszystkich probówek dodać po 2 ml bezwodnika kwasu
octowego i ostro\
nie po ściankach  0.1 ml stę\
. H SO . Zawartość probówek wymieszać i odstawić w ciemne miejsce na 15
2 4
min. Po tym czasie zmierzyć absorbancję przy dł. fali 660 nm. W tabeli poni\
ej podano wartości absorbancji próbek
wzorcowych do wykreślenia krzywej.
Nr próbki Ilość cholesterolu [mg] A
660
Ø 0 0
1 0.2 0.093
2 0.4 0.183
3 0.6 0.286
4 0.8 0.383
5 1 0.463
Przygotowanie próbek badanych
Do analizy u\
ywamy probówek ze szklanym korkiem. Do dwóch probówek dodać kolejno 200 mg masła zwierzęcego oraz
220 mg masła roślinnego, do trzeciej  0.2 ml wody destylowanej (próba ślepa). Następnie do wszystkich dodać po 9.8 ml
chloroformu. Probówki z masłem zwierzęcym i roślinnym wytrząsać ok. 5 min. Dodać do ka\
dej z nich bezw. MgSO i
4
ponownie wytrząsać do uzyskania klarownego roztworu (ok. 5 min). Próbki przesączyć bezpośrednio do probówek a
następnie pobrać z ka\
dej po 5 ml roztworu do nowych probówek ze szklanym korkiem. Dodać po 2 ml bezwodnika
CH COOH i ostro\
nie po ściankach  0.1 ml stę\
. H SO . Dokładnie wymieszać i odstawić w ciemne miejsce na 15 min.
3 2 4
Zmierzyć absorbację ( = 660 nm) względem ślepej odczynnikowej (spektrofotometr Bio-Rad). Z krzywej wzorcowej
zale\
ności absorbancji od ilości cholesterolu wyra\
onego w mg wyznaczyć zawartość cholesterolu w maśle zwierzęcym i
roślinnym. Wyniki wyrazić w mg cholesterolu/100 g masła zwierzęcego i roślinnego.
Zawartość cholesterolu: 0 mg cholesterolu w 100 g masła roślinnego
220  250 mg cholesterolu w 100 g masła zwierzęcego
4
Biochemia: Ćw. 8 - Lipidy
6. WSKAy
NIKI WA
AÅšCIWOÅšCI TA
USZCZÓW
Do chemicznych wskaz
ników właściwości tłuszczów zaliczamy:
1. liczbę kwasową (liczba Kottstorfera)  ilość mg KOH zu\
ytego do zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych w 1g tłuszczu,
2. liczbę zmydlania  ilość mg KOH potrzebna do zmydlenia 1g tłuszczu,
3. liczbę jodową  ilość gram wolnego I przyłączonego do 100g tłuszczu,
2
6.1. OZNACZANIE LICZBY KWASOWEJ TA
USZCZÓW
Tłuszcze mają odczyn obojętny. W wyniku jełczenia następuje częściowa hydroliza tłuszczu. Uwolnione kwasy tłuszczowe nadają
tłuszczom odczyn kwaśny. Określenie zawartości wolnych kwasów tłuszczowych daje odpowiedz
, czy tłuszcz jest świe\
y, czy zjełczały.
Zawartość wolnych kwasów tłuszczowych mierzy się za pomocą liczby kwasowej; w tym celu próbkę tłuszczu miareczkuje się
alkoholowym roztworem KOH.
Wykonanie: Do dwóch kolb sto\
kowych o pojemności 50 ml dodać po 5 g masła świe\
ego i nieświe\
ego, a następnie po 30
ml etanolu. Do trzeciej (próba ślepa) dodać tylko etanol. W celu rozpuszczenia tłuszczu, kolby zawierające masło lekko
podgrzać nad palnikiem. Do roztworu dodać kilka kropli 1% etanolowego roztworu fenoloftaleiny. Szybko miareczkować za
pomocą 0.01 M KOH w obecności fenoloftaleiny do słabo ró\
owego zabarwienia.
Opracowanie wyników: liczbę kwasową (LK) dla masła policzyć wg wzoru:
LK = 5.611 (a  b)/c
gdzie: a  objętość 0.1 M KOH zu\
yta na miareczkowanie próby badanej [ml]
b  objętość 0.1 M KOH zu\
yta na miareczkowanie elanolu [ml] (próba ślepa)
c  ilość tłuszczu [g]
6.2. OZNACZANIE LICZBY JODOWEJ TA
USZCZÓW
TÅ‚uszcze o du\
ej zawartości estrów nienasyconych kwasów tłuszczowych (oleje roślinne) cechują się du\
ą wartością liczby jodowej,
natomiast tłuszcze zawierające niewiele wiązań podwójnych (masło zwierzęce, smalec) mają małą liczbę jodową.
Wykonanie: Przygotować trzy kolby sto\
kowe o pojemności 100 ml z doszlifowanym korkiem. Na folii aluminiowej odwa\
yć
dokładnie 0.1 g oleju i 0.2 g masła zwierzęcego a następnie przenieść olej i masło do kolb, zwil\
ajÄ…c uprzednio korek
roztworem KI. Następnie do ka\
dej z kolb dodać 5 ml chloroformu przepłukując folie, na których został zwa\
ony tłuszcz
(kolba trzecia będzie zawierała wyłącznie chloroform  próba kontrolna). Dokładnie rozpuścić tłuszcz. Dodać 7.5 ml
odczynnika Hanusa. Kolbę starannie zamknąć korkiem i po wymieszaniu pozostawić w ciemności na 30 min. Po upływie
tego czasu dodać 7.5 ml 10% roztworu KI (zmywając nim szyjkę kolby i korek) oraz 25 ml wody destylowanej. W wyniku
reakcji IBr i KI uwalnia się I . Powstały jod odmiareczkować za pomocą 0.1 M roztworu Na S O do słabo ró\
owego
2 2 2 3
zabarwienia. Następnie dodać kilka kropli 1% wskaz
nika skrobiowego i skończyć miareczkowanie.
Opracowanie wyników: liczbę jodową (LJ) policzyć wg wzoru:
LJ = 1.269 (a  b)/c
gdzie: a  objętość 0.1 M Na S O zu\
yta na miareczkowanie próby kontrolnej [ml]
2 2 3
b  objętość 0.1 M Na S O zu\
yta na miareczkowanie próby badanej [ml]
2 2 3
c  ilość tłuszczu [g]
Spodziewane wartości liczby jodowej: masło zwierzęce: 25  38
olej słonecznikowy: 120  145
5
Biochemia: Ćw. 8 - Lipidy
Zalecana literatura:
do ćwiczeń:
"Ćwiczenia z biochemii" pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, W-wa 2003; str. 306  312.
do seminarium:
"Biochemia J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, PWN, W-wa 2005; rozdział "Lipidy i błony biologiczne", str. 319  342 (lub
odpowiedni rozdział we wcześniejszych wydaniach).
Na zajęcia obowiązuje strój ochronny: chałat, rękawiczki jednorazowe oraz okulary ochronne.
6