8009766942

5. Inaktywacja termiczna ligazy

Inkubacja próbek w temperaturze 65°C, 20 min,

6. Trawienie mieszaniny ligacyjnej (z pkt. 4) enzymem restrykcyjnym Hindlll i Mphll03I (oddzielnie).

Wykonanie:

-    zmieszać 10 pl reakcji ligacji z pk. 4 z 5pi mieszaniny z enzymem Hindlll

-    zmieszać 10 pl reakcji ligacji z pk.4 z 5pl mieszaniny z enzymem Mphl 1031 Inkubacja próbek w temperaturze 37°C, 10 min.

Skład mieszaniny reakcyjnej:

-    10 pl reakcji ligacji (2/5 reakcji z pkt. 4)

-    0,5 pl buforu do trawienia

-    4,2plH₂0

-    0,3 pl enzymu restrykcyjnego Hindlll lub Mphl 1031

7. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

-    przygotowanie żelu agarozowego (0,7% w buforze 1 x TBE)

-    przygotowanie próbek DNA do naniesienia na żel (pobrać 10 pl mieszaniny reakcyjnej i dodać 2 pl barwnika; nanieść na żel)

-    rozwijać elektroforezę przez 1 h, a następnie barwić żel w roztworze bromku etydyny

-    wizualizacja żelu w świetle UV (dł. fal 300 nm)

Próbki na żel:

N.C = Nie trawiony DNA faga X

L = Próbka z ligacją(zligowane fragmenty DNA faga X po cięciu enzymem Hindlll) LH = Hindlll X lig = Próbka z ligacją strawiona enzymem Hindlll H = Hindlll X = Próbka strawionego DNA faga X enzymem Hindlll (z pkt. 1)

M = Mphl 1031 X = Próbka strawionego DNA faga X enzymem Mphl 1031 (z pkt. 1) LM = Mph 11031 A, lig = Próbka z ligacją strawiona enzymem Mph 11031

A^AGCTT 23130 TTCGAfA 9416 6682

2322

Hindlll 23130

2027

564

Mphl 1031

ATGCA*T T-fACGTA ₁₀₃₂9 10181 1978 1910

1098

1060

797

715

647

538

526

166

Ryc. 1.5 Mapa restrykcyjna faga X z zaznaczonymi pozycjami miejsc dla enzymów Mphl 1031 oraz Hindm.

12