8857685817

Analiza Zmian na Poziomie Ch Cyklu Komórkowym

Analiza Zmian na Poziomie Ch Cyklu Komórkowym

_ - 120 kDa — - 86 kDa

~ 47 kDa

•-» ~ 34 kDa I* ~ 26 kDa •• ~ 20 kDa Rys. 5. Standard wielkości - Pre-stained Molecular Weight Protein Marker

Masy cząsteczkowe histonow

Histon	Masa - kDa
HI	21,5
H2a	14,0
H2b	13,8
H3	15,3
H4	11,3

Żel zateżaiacy:

0.65 ml mieszaniny monomerów &

-    1.2 ml 0.5M Tris-Cl pH 6.8

-    120 fil 10% SDS

-    3 ml wody

-    150 (il 10% APS _

-    15 pi TEMED ^

10. Przed elektroforezą żel (wraz z szybami) umieszcza się w aparacie, przymocowując czerwonymi klipsami (rys.4) i zalewa buforem elektrodowym (bufor SDS PAGE) - uwaga: przygotowany bufor jest 5 razy stężony.

11.    Poostrożnymwyjęciugrzebieniazżeluniemożna zapomnieć o przepłukaniu studzienek i usunięciu ewentualnych pęcherzy powietrza spomiędzy szyb w dolnej części żelu. Przygotowanie próbek do naniesienia na żel (nie dotyczy markera wielkości):

12.    Do podpisanych probówek odpipetować po 10 i 20 pi każdej próbki. Dodatkowo marker wielkości białek (Rys. 5) — 3 jj.1 oraz komercyjną mieszaninę histonów rdzeniowych 5 pl.

13.    Inkubować preparaty przez 8-10 minut w 95°C-denaturacja białek

14.    Krótko żwirować w mikrowirówce

15.    Nanieść próbki na żel za pomocą wydłużonych tipsów i rozpocząć elektroforezę

Elektroforeza

Warunki natężenia i napięcia, przy których prowadzona jest elektroforeza, są zależne od grubości i długości żelu oraz naszych oczekiwań co do jakości i czasu rozdziału białek.

Zwykle zalecane jest stałe natężenie prądu w granicach 12-30 mA / 1 mm grubości żelu. W przypadku używanych na ćwiczeniach zestawów Hoeffer należy ustawić natężenie prądu 25mA na 1 żel. 12% żel rozwijać do czasu aż czoło barwnika będzie wychodzić z żelu. W przypadku żelu 15% dobrze jest wydłużyć elektroforezę o ok.10 minut.

Barwienie białek w żelu

Spośród wielumetodbarwieniabiałekpoSDS-PAGE wybrano najpowszechniej stosowaną metodę barwienia Coomassie Brillant Blue. W barwieniu Coomassie wykorzystuje się zdolność tego barwnika do niespecyficznego wiązania do białek. Po inkubacji z barwnikiem żel przybiera niebieskawą barwę a prążki wskazują lokalizację białek. Barwnik nie wiąże się z żelem poliakrylamidowym i łatwo go odpłukać, dzięki czemu uzyskuje się wyraźny obraz prążków. Histony są białkami wysoce zasadowymi. W związku z tym ich migracja w żelu SDS jest zaburzona- tzn. położenieprążkównieodzwierciedla prawdziwej wielkości białek.

Wykonanie

1.    Po zakończeniu elektroforezy należy rozmontować aparat i delikatnie rozdzielić szyby.

2.    Żel umieścić w roztworze utrwalającym i zostawić na kołysce laboratoryjnej na 0.5 godziny.

3.    Następnie usunąć utrwalacz i zalać roztworem barwiącym. Barwić do uzyskania wyraźnych prążków- pozostawienie żelu na dłużej w roztworze utrwalającym (np. na noc) przyspiesza barwienie białek.