Przedmiot: Podstawy genetyki klinicznej
II Rok, Wydział Lekarski I
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej UM w Poznaniu
Diagnostyka molekularna w medycynie
Osoba prowadząca: Dr n.biol. Anna Wawrocka
Diagnostyka molekularna chorób genetycznych
Zmiany materiału genetycznego są submikroskopowe, dostępne do badania jedynie metodami biologii
molekularnej.
Są to głównie choroby jednogenowe, ale również wieloczynnikowe i nowotworowe.
Molekularne badania diagnostyczne pozwalają na szybką weryfikację rozpoznania klinicznego i stanowią
nowoczesną metodę diagnostyki wielu chorób uwarunkowanych genetycznie.
Izolacja DNA
- pełna krew obwodowa (limfocyty)
- komórki płynu owodniowego (AFC)
- komórki kosmówki (CVS)
- hodowle fibroblastów
- komórki epitelialne
- cebulki włosów
- plamy krwi, nasienia
- fragmenty tkanek
- szpik kostny
Metody izolacji DNA:
1. Izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbiałczenia preparatów
2. Izolacja DNA przebiegająca przez wysolenie białek z lizatów komórek
3. Izolacja DNA poprzez związanie z nośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie DNA
Izolacja DNA z krwi obwodowej  metodą wysalania białek
Etapy:
1. Liza komórek bezjądrzastych
2. Liza leukocytów
3. Odbiałczanie
4. Wytrącanie DNA alkoholem
Hybrydyzacja (renaturacja) 
Tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi niciami DNA lub RNA pochodzącymi z różnych z
ródeł.
Oddziaływanie badanego fragmentu DNA i sondy molekularnej prowadzi do utworzenia hybrydu (dupleksu) o
dwuniciowej strukturze.
Metody hybrydyzacji molekularnej:
-Southern Blotting,
-DNA fingerprinting,
-Northern blotting,
-In situ hybridization (FISH).
Sondą molekularną mogą być:
-syntetyczne oligomery
-syntetyczne bądz
naturalne geny lub ich fragmenty
-cDNA
-fragmenty chromosomów
-całe genomy bakteryjne
Sonda molekularna musi być zdenaturowana (jednoniciowa). A
ączenie sondy molekularnej z docelowym fragmentem
kwasu nukleinowego zachodzi zgodnie z komplementarnością zasad.
Sonda jest wyznakowana radioaktywnie lub nieradioaktywnie np. fluorescencyjnie.
1
Hybrydyzacja typu Southern (ang. Southern blot hybridization) 
Stosowana najczęściej, dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA spośród mieszaniny
fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.
Stosując hybrydyzację typu Southern można wykryć:
- rearanżacje genowe np. delecje albo insercje, większe od 50-100 pz (Dystrofia mięśniowa Duchenne a)
-mutacje punktowe, które tworzą nowe lub zmieniają dotychczasowe miejsce restrykcyjne dla enzymu, stosowanego
do trawienia DNA
Hybrydyzacja typu Northern Blot (ang. Northern blot hybridization)  dotyczy hybrydyzacji RNA pacjenta z sondą
molekularną. Stosowana w celu badania ekspresji genów.
DNA Fingerprinting
W metodzie tej wykorzystuje się obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR (variable
number of tandem repeats)  zmienna liczba tandemowych powtórzeń. W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami
molekularnymi rozpoznającymi jednocześnie kilkanaście loci otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny
obraz fragmentów DNA tzw. fingerprint, odcisk genetyczny
Zastosowanie:
-ustalanie ojcostwa
-badania medyczno-sądowe
PCR- (ang.polymerase chain reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy
�� Metoda PCR przyspieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.
�� Kary Mullis zastosował termostabilną polimerazę w reakcji łańcuchowej polimerazy, w 1987r.
�� Nagroda Nobla z chemii w 1993r.
�� Reakcja ta odzwierciedla naturalny proces replikacji i umożliwia w warunkach in vitro szybkie powielenie
wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu reakcji odwrotnej transkrypcji).
�� Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest
komplementarny do jednego końca sekwencji docelowej DNA. Startery te są wydłużane w kierunku
przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA
�� W cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:
- denaturacja dwuniciowej matrycy  90-95�C,
- wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65�C,
- synteza nici komplementarnej 68-72�C
�� Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki DNA umieszczone w
żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej elektrody, a ich szybkość zależy od
wielkości cząsteczki  im mniejsze tym szybciej będą się przesuwały w żelu. Wybarwione bromkiem etydyny
(mutagen interkalujący DNA) są widoczne po naświetleniu światłem UV.
PCR-RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism)
Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Polega ona na amplifikacji fragmentu DNA, w obrębie
którego występuje marker RFLP (fragment DNA zawierający miejsce restrykcyjne), a następnie jego trawieniu
odpowiednim enzymem restrykcyjnym.
Zastosowanie:
- identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny
Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia
Multipleks PCR
�� jednorazowo można amplifikować
ok.10 markerów
�� można badać DNA zmieszany
i zdegradowany
Zastosowanie: duże mutacje genowe: delecje, duplikacje, insercje
Hybrydyzacja ASO (ang. allele specific oligonucleotide)
ż� polega na hybrydyzacji z sondą specyficzną
dla produktu PCR
ż� sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub zmutowany
Zastosowanie:
wykrywanie mutacji punktowych, które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych
Przykład: głuchota wrodzona, mukowiscydoza
2
MSP-PCR - PCR specyficzny dla metylacji (ang.methylation specific PCR)
�� Do wykrywania metylacji CpG w genomowym DNA
�� Dwusiarczyn sodu przekształca niemetylowaną cytozynę na uracyl
�� W celu uwidocznienia efektu metylacji, DNA modyfikuje się kwaśnym siarczynem sodowym Porównanie
próbki DNA poddanej działaniu dwusiarczynu i próbki normalnej ujawnia metylację cytozyny
�� PCR prowadzi się z dwoma zestawami starterów, specyficznymi dla kopii metylowanej i niemetylowanej.
Przykłady: Zespół Pradera - Williego (PWS), Zespół Angelmana (AS)
U podstaw patogentycznych PWS znajduje się regulacja ekspresji genów nazywana rodzicielskim piętnem
genomowym. PWS spowodowany jest brakiem aktywności genów w regionie chromosomu 15 pochodzącym od ojca,
które ulegają piętnowaniu (są nieaktywne) na chromosomie 15 pochodzącym od matki. Zmiany w DNA w tym samym
cytogenetycznie regionie, ale pochodzące od matki odpowiedzialne są za zespół Angelmana.
Wynik badania molekularnego dla pacjentów z zespołem PWS i AS:
Kontrola- obecność kopii matczynej i ojcowskiej
PWS - obecny tylko fragment pochodzący z kopii matczynej
AS - obecny tylko fragment pochodzący z kopii ojcowskiej
Sekwencjonowanie DNA, główne metody
�� Metoda enzymatyczna  polimeraza DNA syntetyzuje komplementarną kopię matrycy DNA
�� Metoda chemiczna  znakowany fragment DNA ulega reakcji ze związkami specyficznymi dla
poszczególnych zasad
Sekwencjonowanie DNA, metodą enzymatyczną
�� Metoda enzymatyczna została opracowana przez Sangera i wsp. W 1977r.
�� Opiera się na zdolności polimerazy DNA do wbudowywania 2 3 -dideoksynukleozydotrifosforanów (ddNTP).
Wbudowanie ddNTP (terminatora) powoduje zatrzymanie elongacji w miejscu A, C, G lub T. W każdej reakcji
stosowany jest tylko jeden nukleotyd terminujący.
QF-PCR (ang. Quantitive fluorescence polymerase chain reaction)
�� QF-PCR znalazła zastosowanie w diagnostyce prenatalnej (wybranych aberracji chromosomowych). Jest to
ocena ilości kopii chromosomów 13, 18, 21, X i Y.
�� Opiera się na wykorzystaniu jako markerów sekwencji STR (ang. short tandem repeats)
�� Rutynowo z
ródłem DNA są amniocyty występujące w płynie owodniowym, pobieranym na drodze
amniopunkcji od około 13 tygodnia ciąży
�� Startery do amplifikacji poszczególnych STR są znakowane fluorescencyjnie, odczyt odbywa się za pomocą
sekwenatora kapilarnego
PCR w czasie rzeczywistym  (ang. Real Time PCR)
�� Metoda ilościowa oparta na amplifikacji DNA in vitro- opiera się na pomiarze liczby kopii DNA, przez pomiar
fluorescencji
Zastosowania aplikacji real-time PCR:
�� Ilościowe określanie ekspresji genów
�� Testowanie stabilności genetycznej
�� Wydajność terapii lekowych/monitorowanie leków
�� Ilościowe określanie DNA wirusowego
�� Detekcja patogenów
�� Uszkodzenia DNA (niestabilność mikrosatelitarna)
�� Określanie czasu ekspozycji na promieniowanie
�� Obrazowanie in vivo procesów komórkowych
�� Studia nad DNA mitochondrialnym
�� Detekcja metylacji
�� Detekcja inaktywacji chromosomu X
�� Genotypowanie, analiza krzywej topnienia kwasów nukleinowych
�� Wykrywanie trisomii, poszczególnych kopii jednogenowych
�� Wykrywanie mikrodelecji
Mikromacierze (ang. DNA microarray)- rodzaje
�� Ze względu na rodzaj wykrywanych sekwencji -
�� mikromacierze do badania ekspresji genów
l� najczęściej stosowane - sondy w obrębie sekwencji mRNA
l� mikromacierze eksonowe (sondy to sekwencje eksonów)
l� mikromacierze pokrywajace genom (ang. tiling array)-do badania ekspresji obszarów pozagenowych
3
l� mikromacierze do badania splicingu (ang. splicing array)- badanie ekspresji różnych form
splicingowych tego samego genu
�� mikromacierze do badania sekwencji genów (genotypowania)
l� mikromacierze SNP - odróżnianie jednonukleotydowych polimorfizmów DNA
Mikromacierze typu SNP
�� Zastosowanie mikromacierzy DNA typu SNP umożliwia analizę w pojedynczym eksperymencie nawet kilkuset
mutacji i polimorfizmów odpowiedzialnych za rozwój chorób genetycznych.
�� Mikromacierze DNA wykorzystywane są do poznawania mechanizmów chorobotwórczych oraz oceny ryzyka
rozwoju chorób mających podłoże genetyczne.
Mikromacierze ekspresyjne
�� Przykłady zastosowań
�� Znajdowanie genów reagujących zmianą ekspresji na zmiany:
l� w środowisku (np. podanie leku)
l� w genotypie (np. obecność transgenu)
�� Znajdowanie genów, których ekspresja różni się
l� między tkankami
l� podczas rozwoju
l� w tkance chorej i zdrowej
l� między gatunkami.
4