Temat zajęć: Czynniki warunkujące aktywność enzymów na przykładzie fosfatazy kwaśnej

Prowadzący: Dr inż. Sławomir Orzechowski

Skład zespołu: xxxx

Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest badanie wpływu takich czynników jak: stężenie enzymu, stężenie jonów wodorowych (pH), temperatura, obecność inhibitora na przebieg reakcji.

Wstęp teoretyczny: Aktywność fosfatazy oznacza się używając sztucznych substratów: fenylofosforanu, fosforanu fenoloftaleiny, 2-glicerofosforanu i p-nitrofenylofosforanu (pNPP). Ostatni jest najczęściej stosowanym substratem - ze względu na tworzenie kolorowych kompleksów. Podczas ćwiczenia wykorzystywałyśmy fosfatazę kwaśną uzyskaną z siewek pszenżyta. W trakcie ćwiczeń zachodziła reakcja:

Powstający p-nitrofenol, w środowisku zasadowym, przyjmuje barwę żółtozieloną.

Zadanie 1. Obliczanie szybkości reakcji

Dane do kolejnych doświadczeń każda z nas zbierała oddzielnie.

Obliczamy szybkość reakcji na podstawie wzoru:

Korzystamy z programu Microsoft Excel 2002 i zestawiam dane w tabelce:

(przyjmując za Absorbancję dla p-nitrofenolu przy 420 nm wartość 0,002 , a za masę molową 139 g/mol)

Absorbancje(420)	Warunki	reakcji	Czas		Szybkość reakcji
Doświadczenie 1
0,148	0,25	ml	15	min	0,035	μmol/min
0,238	0,5	ml	15	min	0,057	μmol/min
0,339	0,75	ml	15	min	0,081	μmol/min
0,429	1	ml	15	min	0,103	μmol/min
0,629	1,25	ml	15	min	0,151	μmol/min
Doświadczenie 2
0,14	3	pH	15	min	0,034	μmol/min
0,174	4,4	pH	15	min	0,042	μmol/min
0,217	5,2	pH	15	min	0,052	μmol/min
0,206	6	pH	15	min	0,049	μmol/min
Doświadczenie 4.
0,211	30	ºC	15	min	0,051	μmol/min
0,202	40	ºC	15	min	0,048	μmol/min
0,194	50	ºC	15	min	0,047	μmol/min
0,163	60	ºC	15	min	0,039	μmol/min
Doświadczenie 5.
0,181	z	inhibitorem	15	min	0,043	μmol/min
0,248	bez	inhibitora	15	min	0,059	μmol/min

Zadanie 2. Sporządzanie wykresów.

Sporządzamy wykresy za pomocą programu Graph(v.4.3):

Zadanie 3. Aktywność fosfatazy kwaśniej w różnych temperaturach

Obliczenia: Zestawiamy w tabelce (obliczonej w Excelu) wyniki aktywności fosfatazy w różnych temperaturach w stosunku do temperatury 30 ºC.

30	ºC	0,051	μmol	100,00%
40	ºC	0,048	μmol	95,73%
50	ºC	0,047	μmol	91,94%
60	ºC	0,039	μmol	77,25%

Wnioski: Aktywność enzymu fosfatazy kwaśniej spada w temperaturach powyżej 30 ºC. Jest to spowodowane powolną denaturacją enzymu.

Zadanie 4. Porównanie aktywności fosfatazy kwaśniej z inhibitorem z aktywnością fosfatazy kwaśnej bez inhibitora.

z	inhibitorem	0,043405	μmol	72,98%
bez	inhibitora	0,059472	μmol	100,00%

Wnioski: Zastosowanie inhibitora zahamowało reakcję w 72,98 %. Dowodzi to faktowi, iż obecność inhibitora wpływa ujemnie na szybkość reakcji.

---