Wydział Chemiczny Politechniki Gda

ń

skiej

Katedra Technologii Leków i Biochemii

Kultury tkankowe i komórkowe ro

ś

lin i zwierz

ą

t

Mikrorozmna

ż

anie ro

ś

lin prowadzonych w kulturach in vitro

Wst

ę

p.

Mikrorozmna

ż

anie jest metod

ą

rozmna

ż

ania wegetatywnego w kulturze

in vitro, u

ż

ywan

ą

do masowego mno

ż

enia ro

ś

lin na skal

ę

produkcyjn

ą

. Dynamicznie

rosn

ą

ce

komercyjne

znaczenie

tej

gał

ę

zi

produkcji

ro

ś

linnej

znajduje

odzwierciedlenie w jej współczesnej nazwie: przemysł in vitro (ang. in vitro industry,
the micropropagation industry).

Metoda kultury in vitro była doskonalona od pocz

ą

tku XX wieku,

lecz rozmna

ż

anie ro

ś

lin na skal

ę

produkcyjn

ą

z jej zastosowaniem stało si

ę

mo

ż

liwe

dopiero od 1965 roku, kiedy to Murashige w USA opracował sposób klonalnego
rozmna

ż

ania storczyków. Metod

ę

t

ę

zaadoptowano do rozmna

ż

ania innych wa

ż

nych

gospodarczo ro

ś

lin, głównie ozdobnych i sadowniczych. Obecnie jest ona najszerzej

wykorzystywan

ą

technik

ą

w biotechnologii. Znalazła zastosowanie przede wszystkim

w produkcji takich ro

ś

lin, które trudno rozmna

ż

aj

ą

si

ę

wegetatywnie za pomoc

ą

metod tradycyjnych (ro

ś

liny ozdobne, drzewa le

ś

ne, odmiany heterozygotyczne),

oraz ro

ś

lin elitarnych, o du

ż

ej warto

ś

ci jednostkowej. Tylko w niewielkim stopniu

słu

ż

y ona dotychczas w rozmna

ż

aniu ro

ś

lin rolniczych (ziemniaków, zbó

ż

, ro

ś

lin

tropikalnych. Mikrorozmna

ż

anie mo

ż

na te

ż

wykorzysta

ć

do rozmna

ż

ania form

poliploidalnych czy aneuploidalnych, których rozmna

ż

anie generatywne daje

niejednolite potomstwo).

Liczba gatunków rozmna

ż

anych za pomoc

ą

kultury in vitro wynosi obecnie

około 300, natomiast na

ś

wiecie produkuje si

ę

za pomoc

ą

kultury in vitro około

800 mln sztuk ro

ś

lin, z czego 90% stanowi

ą

ro

ś

liny ozdobne. Ocenia si

ę

,

ż

e produkcja europejska wynosi około 200 mln sztuk rocznie, a najwa

ż

niejszym

producentem europejskim jest Holandia (62 mln sztuk rocznie), nast

ę

pnie Francja,

Polska, Włochy i Niemcy. Oprócz krajów europejskich, czołowymi producentami
ro

ś

lin w laboratoriach in vitro s

ą

USA (110 mln szt.) i Indie (130 mln szt.). W krajach

tych głównym produktem mikrorozmna

ż

ania s

ą

ozdobne ro

ś

liny doniczkowe

o dekoracyjnym ulistnieniu, a tak

ż

e ro

ś

liny wa

ż

ne gospodarczo np. ziemniaki, byliny,

ro

ś

liny przyprawowe.

W Polsce działa obecnie około 20 laboratoriów zajmuj

ą

cych si

ę

mikrorozmna

ż

aniem, głównie ro

ś

lin ozdobnych (gerbera, ró

ż

anecznik, azalia,

storczyk, fikus, lilia, chryzantema, gloksynia, go

ź

dzik, papro

ć

, primula), a tak

ż

e

borówki wysokiej, truskawki,

ż

urawiny i je

ż

yny.

Krajowa produkcja sadzonek in vitro jest jedn

ą

z najwi

ę

kszych w Europie i

szacunkowo wynosi około 70 – 100 mln sztuk na rok. Zaspokaja ona potrzeby
rynkowe naszego kraju, ale w wi

ę

kszo

ś

ci jest eksportowana do Holandii, Anglii,

Izraela, W

ę

gier, Czech, Białorusi, Bułgarii, Turcji, USA oraz na Ukrain

ę

, Litw

ę

i

Łotw

ę

.

Laboratoria włoskie dostarczaj

ą

na rynek około 20 mln sztuk ro

ś

lin

sadowniczych, szczególnie winoro

ś

li i brzoskwi

ń

. Laboratoria belgijskie specjalizuj

ą

si

ę

w produkcji ozdobnych ro

ś

lin drzewiastych (Rhododendron).

Rozmna

ż

anie wegetatywne ro

ś

lin w kulturach in vitro mo

ż

na prowadzi

ć

w

oparciu o:

a) pobudzanie rozwoju p

ą

ków bocznych (metoda najlepiej poznana)

b) formowanie p

ą

ków przybyszowych bezpo

ś

rednio lub po

ś

rednio przez kalus

c) embriogenez

ę

somatyczn

ą

Embriogeneza somatyczna to proces biologiczny, podczas którego w

warunkach in vitro formuj

ą

si

ę

zarodki z komórek wegetatywnych. Otrzymane w ten

sposób zarodki mog

ą

posłu

ż

y

ć

do produkcji sztucznych nasion.

Sztuczne nasiona to specjalnie spreparowane zarodki somatyczne (komórki
somatyczne, zacz

ą

tki ro

ś

liny) zdolne do regeneracji na skal

ę

komercyjn

ą

,

umieszczone w osłonce ochronno – od

ż

ywczej.

Sposób prowadzenia kultury

.

Bardzo istotne znaczenie w procesie mikrorozmna

ż

ania ro

ś

lin ma skład

po

ż

ywki (głównie zawarto

ść

hormonów) oraz jej rodzaj (stała czy płynna). Najcz

ęś

ciej

stosuje si

ę

po

ż

ywk

ę

według Murashige’a i Skooga (1962) lub jej modyfikacj

ę

,

rzadziej po

ż

ywk

ę

B

5

według Gamborga i in. (1968).

W procesie mikrorozmna

ż

ania mo

ż

na wyró

ż

ni

ć

nast

ę

puj

ą

ce etapy:

1. zało

ż

enie kultury – obejmuje wyło

ż

enie sterylnych eksplantatów pierwotnych

na po

ż

ywk

ę

stymuluj

ą

c

ą

wytwarzanie p

ą

ków lub cebulek przybyszowych.

2. namna

ż

anie – najcz

ęś

ciej prowadzi si

ę

na po

ż

ywkach z wysok

ą

zawarto

ś

ci

ą

cytokinin indukuj

ą

cych tworzenie nowych p

ę

dów (mikrocebulek). Wytworzone

p

ę

dy mog

ą

by

ć

ponownie wykładane na tak

ą

sam

ą

po

ż

ywk

ę

, gdzie proces ten

si

ę

powtarza. Subkultur

ę

najcz

ęś

ciej zakłada si

ę

co 4 tygodnie i przeprowadza

od 10 do 15 razy.

3. ukorzenianie p

ę

dów – przeprowadza si

ę

w zale

ż

no

ś

ci od gatunku ro

ś

liny

zarówno in vitro, jak i in vivo. Stosuje si

ę

cz

ę

sto po

ż

ywki z wysokim st

ęż

eniem

auksyn, obni

ż

on

ą

zawarto

ś

ci

ą

soli mineralnych oraz dodatkiem w

ę

gla

aktywnego.

Celem mikrorozmna

ż

ania jest uzyskanie du

ż

ej liczby genetycznie

jednolitych ro

ś

lin. W trakcie trwania kultury in vitro mo

ż

e by

ć

zachowana stabilno

ść

genetyczna materiału ro

ś

linnego lub mo

ż

e wyst

ą

pi

ć

spontaniczna zmienno

ść

(tzw.

zmienno

ść

somaklonalna), w wyniku której regenerowane ro

ś

liny mog

ą

wykazywa

ć

,

na pewien czas lub na trwałe, inne cechy ni

ż

wyj

ś

ciowy materiał rodzicielski.

W mikrorozmna

ż

aniu zmienno

ść

jest wad

ą

, ale stwierdzono,

ż

e mo

ż

e ona by

ć

nowym

ź

ródłem zmienno

ś

ci genetycznej mo

ż

liwym do wykorzystania w hodowli

twórczej. Zmienno

ść

somaklonalna pozwala znacznie poszerzy

ć

zakres zmienno

ś

ci

genetycznej ro

ś

lin uprawnych, co jest szczególnie wa

ż

ne przy ograniczonej puli

genowej lub w przypadku gatunków u

ż

ytkowych, które utraciły zdolno

ść

do

rozmna

ż

ania generatywnego. Zmiany w kulturach in vitro mog

ą

dotyczy

ć

tak

ż

e

takich wła

ś

ciwo

ś

ci ro

ś

lin, których nie mo

ż

na osi

ą

gn

ąć

na drodze konwencjonalnej.

Zalet

ą

zmienno

ś

ci somaklonalnej jest tak

ż

e mo

ż

liwo

ść

uzyskania ro

ś

lin ró

ż

ni

ą

cych

si

ę

tylko jedn

ą

cech

ą

przy zachowaniu innych cech odmianowych. Jej wykorzystanie

jest równie

ż

ta

ń

sz

ą

od innych metod

ą

manipulacji genetycznej.

Zalety i wady mikrorozmna

ż

ania

.

Podstawow

ą

zalet

ą

stosowania tej techniki jest mo

ż

liwo

ść

uzyskania w krótkim

czasie bardzo du

ż

ej ilo

ś

ci ro

ś

linek z materiału wyj

ś

ciowego. Liczba namno

ż

onych

ro

ś

linek zale

ż

y od odmiany, rodzaju eksplantatu, warunków fizycznych kultury,

składu po

ż

ywki oraz liczby przeprowadzonych subkultur. Np. teoretyczna wydajno

ść

namna

ż

ania ze

ś

redniej wielko

ś

ci cebuli w kulturze wytrz

ą

sanej wynosi 2000

mikrocebulek w ci

ą

gu 45 dni.

Stosowanie do mikrorozmna

ż

ania kultur merysystemów wierzchołkowych

stwarza mo

ż

liwo

ść

uwalniania materiału hodowlanego od wirusów i innych

patogenów. Im mniejszy jest izolowany merystem (0,5 do 1 mm), tym wi

ę

ksza

skuteczno

ść

eliminacji wirusa. W celu zwi

ę

kszenia prawdopodobie

ń

stwa otrzymania

zdrowych ro

ś

lin stosuje si

ę

cz

ę

sto kultur

ę

merysytemów ł

ą

cznie z termoterapi

ą

lub chemoterapi

ą

.

Inn

ą

korzy

ś

ci

ą

stosowania tej techniki jest mo

ż

liwo

ść

przechowywania

zregenerowanych ro

ś

linek przez kilka miesi

ę

cy w obni

ż

onej temperaturze. Pozwala

to na spokojn

ą

, rozło

ż

on

ą

w czasie produkcj

ę

in vitro i wysadzanie ro

ś

lin

w optymalnym terminie. Stosuje si

ę

równie

ż

długoterminowe przechowywanie in vitro

merysystemów lub p

ę

dów przez okres 2-5 lat w banku genów.

Kolejn

ą

zalet

ą

mikrorozmna

ż

ania jest łatwy transport rozmno

ż

onego

materiału. Szacunkowo około 40 000 ro

ś

linek mo

ż

na umie

ś

ci

ć

w paczce wa

żą

cej

15 kg. Ułatwia to transport i mi

ę

dzynarodow

ą

wymian

ę

materiału ro

ś

linnego.

Trudno

ś

ci, z jakimi spotyka si

ę

w trakcie mikrorozmna

ż

ania:

a) bakteryjne i grzybowe ska

ż

enie eksplantatów pierwotnych;

b) witryfikacja (zeszklenie) zregenerowanych ro

ś

lin;

c) trudno

ś

ci ukorzeniania i adaptacji do warunków normalnej uprawy;

d) wyst

ę

powanie niekorzystnych fizjologicznych modyfikacji w

ś

ród namno

ż

onych

ro

ś

lin (np. słaby wigor tych ro

ś

lin, słaby rozwój systemu korzeniowego,

opó

ź

nienie kwitnienia).

Cz

ęść

praktyczna.

Celem

ć

wiczenia jest mikrorozmna

ż

anie ro

ś

lin, pochodz

ą

cych z hodowli

in

vitro

zało

ż

onych

przez

studentów

na

wcze

ś

niejszym

laboratorium.

Do mikrorozmna

ż

ania wykorzystane zostan

ą

merystemy wierzchołka p

ę

du

i fragmenty łodygi.

Materiał ro

ś

linny:

3 mm eksplantaty wierzchołkowe dowolnej ro

ś

liny

1 – 3 mm fragmenty łodygi

Materiały sterylne:
Płytki Petriego
Penseta, skalpel
Po

ż

ywka MS bez hormonów

Po

ż

ywka MS zawieraj

ą

ca auksyn

ę

(NAA – kwas naftalenooctowy, 0.1 mg/l)

oraz cytokinin

ę

(BAP – 6 –benzyloaminopuryn

ę

, 0.5 mg/l), pH 5.8

Wykonanie

ć

wiczenia:

Ć

wiczenie wykonuje si

ę

pod wyci

ą

giem laminarnym z nawiewem sterylnego

powietrza.

1. Za pomoc

ą

sterylnej pensety, dobrze opalonej w płomieniu palnika, wyj

ąć

ro

ś

lin

ę

ze słoika i umie

ś

ci

ć

j

ą

na płytce Petriego.

2. Odci

ąć

przy pomocy skalpela około 3 mm merystem wierzchołkowy

oraz 1- 3 mm fragment łodygi, a reszt

ę

ro

ś

liny umie

ś

ci

ć

z powrotem w słoiku.

3. U

ż

ywaj

ą

c dobrze opalonej pensety wyło

ż

y

ć

pobrane eksplantaty pierwotne

na po

ż

ywk

ę

MS: merystem wierzchołkowy na po

ż

ywk

ę

MS bez hormonów,

a fragment łodygi na po

ż

ywk

ę

MS z hormonami.

4. Słoiki zabezpieczy

ć

dodatkowo parafilmem, dobrze opisa

ć

i umie

ś

ci

ć

w fitotronie na około 8 tygodni.

5. Obserwowa

ć

wygl

ą

d ro

ś

lin, liczb

ę

ro

ś

lin uzyskanych z eksplantatu, szybko

ść

powi

ę

kszania si

ę

hodowli.

Przygotowanie sprawozdania.

1. Opisa

ć

sposób wykonania

ć

wiczenia.

2. Rola jednego dowolnie wybranego fitohormonu we wzro

ś

cie i rozwoju ro

ś

lin.

3. Wymieni

ć

znane (poza mikrorozmna

ż

aniem) rodzaje kultur in vitro. Opisa

ć

któr

ąś

z nich.

4. Opisa

ć

sposoby uwalniania ro

ś

lin od patogenów.

Literatura uzupełniaj

ą

ca:

1. Biotechnologia ro

ś

lin. S. Malepszy, PWN 2004.

2. Wprowadzenie do biotechnologii w genetyce i hodowli ro

ś

lin. Praca zbiorowa

pod kierownictwem S. Malepszego, Wydawnictwo SGGW-AR, Warszawa
1990.

3.

www.horticentre.pl

- Skierniewicki Portal Ogrodniczy