PRZEPŁYW INFORMACJI U MIKROOGRANIZMÓW
STRUKTURA DNA
Nici antyrównoległe – o przeciwnej polarności – przekłada się na sposoby replikacji – będą replikowane w inny sposób
DNA, 10% RNA, 10% białek – spermina, spermidyna (spełniają inne funkcje niż histony – spermina i spermidyna głównie funkcja stabilizująca)
REPLIKACJA – POCZĄTEK – ori C – 442 nukleotydy – miejsce początku replikacji – jest to jedno miejsce, jedne widełki replikacyjne – proces replikacji zachodzi w obie strony
Biegnie w dwóch kierunkach
Jest to proces ciągły
Po drugiej stronie biegunowo jest miejsce
MODEL REPLIKACJI SEMIKOSERWATYWNEJ – wymaga separacji nici DNA – połowa nowej powstającej nici jest nicią starą, a druga jest dosyntezowana
Do zakończenia procesu replikacji następuje wtedy gdy dojdzie do miejsca terminacji na drugim biegunie cząsteczki DNA
Podział komórki dopiero po podziale DNA i przyłączeniu do błony komórkowej
W zależności od ilości miejsc inicjacji wydłuża się czas generacji – czas do kolejnego podziału. Jeżeli inicjacja zajdzie zanim DNA całkowicie się podzieli to czas jest znacznie krótszy.
SUPERHELISA DNA
Nie każda postać konformacyjna helisy znajdującej się w cytoplazmie może być replikowana. Wprowadzenie superstruktury – taka trójwymiarowa superstruktura to odpowiednio zwinięta dwuniciowe DNA
Konformacja superstruktury:
+ - zwinięta zgodnie ze skrętem alfa-helisy – ma tendencje do zwijania się – niemożliwa replikacja
- - zwinięta przeciwnie do skrętu alfa-helisy – wymaga energii do stabilizacji – kluczowa do replikacji
Superstruktura to mniej więcej 15 par zasad – jeden skręt
U bakterii jest enzym – topoizomeraza – zmienia konformację przestrzenną makrocząsteczek, wprowadza odmienną przestrzenną strukturę – izomeracji ulega trójwymiarowa struktura DNA – brak zmian chemicznych – enzym hydrolizuje jedno wiązanie fosfodiestrowe ( na jednej nici) – wokół tego fragmentu może dochodzić do swobodnej reakcji – następnie to wiązanie ulega kowalencyjnemu przyłączeniu dzięki innemu enzymowi. Tą topoizomerazą jest giraza zależna od energii z ATP – może wprowadzić superstrukturę dodatnią i ujemną. Ten enzym też ma aktywność ligazową, może zatem też połączyć te nukleotydy (te których wiązanie zostało shydrolizowane)
Powstawanie superstruktury
1. Stan relaksacji
2. Wprowadzanie superstruktury – struktura pośrednia – na jednym zgodnie z alfa-helisą, a na drugiej stronie rpzeciwnie do alfa-helisy (stabilizacja całej superstruktury)
3. Następnie zmiana skrętu i kowalencyjne zamknięcie superstruktury ujemnie skręconej
Wydłużanie nici 5’ do 3’ wolnego końca – energia pochodzi z hydrolizy wiązania fosfodiestrowego
BIAŁKA BIORĄCE UDZIAŁ W REPLIKACJI DNA U BAKTERII
BIAŁKO – SUBSTRAT – FUNKCJE
ssBs (wiążące) – ssDNA – utrzymuje separację nici
topoizomerazy (giraza) – dsDNA; ATP – wprowadzenie ‘-‘ superhelisy stan wysokoenergetyczny
primaza (polimeraza RNA DNA-zależna) – ssDNA; rNTP (rybonukleotydy) – synteza polimeru RNA (primer)
DNA polimeraza II – brak (polimeraza DNA II nie jest konieczna do normalnego wzrostu) – replikacja (odpowiedź SOS; przestawienie metabolizmu bakterii)
Helikazy – dsDNA – rozwijanie nici DNA w widełkach replikacyjnych (odpowiedzialne za rozpad wiązań wodorowych, te nici stabilizuje ssBs)
DNA-polimeraza III
1. Syntetaza – 3’-OH-koniec primera RNA dNTP – synteza nowej nici DNA
2. Egzonukleaza – błędnie sparowane zasady – naprawa DNA
DNA-polimeraza I
1. RNA egzonulkeaza – RNA-primer – usuwa
2. DNA egzonukleaza – błędnie sparowane zasady – usuwa błędy
3. Syntetaza – ssDNA – zastępuje RNA primer przez DNA
DNA ligaza – ssDNA-fragmenty – łączenie
REPLIKACJA
Synteza nici opóźniającej
Inicjacja – RNA primer wydłużenie 5’ do 3’ primera RNA; oddysocjowanie primerazy przyłączanie dNTP do primera polimeraza DNA III polimeraza DNA I – uzupełnia luki degraduje primer kompletowanie DNA – polimeraza DNA I ligaza DNA – łączy wolne końce
Widełki replikacyjne – helikazy – ssBs – primaza na nici opóźniającej; fragm. Okazaki – polimeraza DNA III na nici wiodącej
NAPRAWA DNA
Przyłączenie nieprawidłowego (energia z nukleotydu w postaci trójfosforanu) i usunięcie go
MODEL TOCZĄCEGO SIĘ KOŁA – umożliwia genetyczne transfery między bakteriami
Zachodzi najczęściej w elementach genetycznych dodatkowych, np. plazmidach
Wolny koniec 3’ – nacięcie jednej nici polimeraza DNA – addycja dNTP do wolnego 3’-OH nić, która została zastąpiona ssDNA
Ta wolna nić od 5’ końca może być przekazywana do drugiej komórki bakterynej – na niej też może zajść proces replikacji, ale już w drugiej komórce – powstała nić jednak nie będzie replikacją ciągłą, tylko za pomocą fragm. Okazaki – w rezultacie komórka zyska fragment genetyczny w postaci podwójnej helisy
Komórka, która była dawcą zachowa podwójną helisę, a druga komórka zyska takie pozachromosomalne DNA
BIOSYNTEZA BIAŁEK
Polimeraza RNA – matrycą jest ‘+’ ssDNA-sensowna
Transkrypt mRNA – trwa około 2 minuty – Degradosom kompleks mRNA i endorybonukleazy metabolizującej RNA
TYPY RNA
1. rRNA – stabilny; 3 rodzaje w komórce strukturalny, rybosomy
2. mRNA – u E. coli – około 2 minuty; łączy się z rybosomami
3. tRNA – stabilny; minimum 31 rodzajów, transportuje aminokwasy
tRNA
miejsce łączenia aminokwasu 3’ koniec (do grupy hydroksylowej), nukleotyd adeninowy. Syntetaza aminoacylo-tRNA wymaga ATP
tRNA może być zmodyfikowany
(po włączeniu nukleotydu w strukturę tRNA)
- 5-metylocytozyna
- N6-metyloadenina
- pseudourydyna
BIOSYNTEZA BIAŁEK
Wiele miejsc transkrypcji
Translacja-polisomy – więcej niż 1 rybosom przyłączony do mRNA – kompleks
Kodony sygnalne:
UAA; UAG; UGA – terminalne
AUG-metionina – startowy
PULA INICJACYJNA
Translacja: inicjacja, elongacja, terminacja
Formylo-metionina – konieczny czynnik
Elongacja NC
Rosnący polipeptyd
Miejsce P – wiąże peptydylo-tRNA
Miejsce A – wiąże aminoacylo-tRNA
Terminacja:
Kodony UAA; UAG; UGA
RF – czynnik uwalniający dysocjacja rybosomów
Czynnik elongacyjny +GTP
Wolny tRNA
Kolejny aminoacylo-tRNA
Kierunek ruchu rybosomów na mRNA do 3’ końca
Cykl elongacyjna u E. Coli
Aminoacylo-tRNA przyłączony do EP-Tu – GTP
Następnie transpeptydacja
Wolna grupa aminowa z grupą karboksylową na łańcuchu polipeptydowym
REGULACJA BIOSYNTEZY BIAŁEK
BIAŁKA:
1. konstytutywne – białka stałe; występują stale w określonym stężeniu
2. indukowane – powstające w wyniku określonej zmiany sytuacji w komórce, np. metabolizujące laktozę ale też wiele innych
KONTROLA TRANSKRYPCJI – aktywność polimerazy RNA
Inicjacja transkrypcji wymaga czynnika sigma
Sekwencja promotorowa jest rozpoznawana przez kompleks tworzący bakteryjną polimerazę RNA – sekwencja korowa – 5 polipeptydów + czynnik sigma
Po przyłączeniu może dojść do replikacji
REGULACJA BIOSYNTEZY BIAŁEK
KONTROLA TRANSKRYPCJI – układ genów operonu
1. szlaki kataboliczne (szlaki rozpadu) – indukcja enzymów, substrat-induktor – enzymy, które są produktami genów operonu są syntezowane w obecności substratu, jest on induktorem, kontrola na poziomie transkrypcji
2. szlaki anaboliczne – represja, sprzężenie zwrotne – końcowy produkt szlaku – represor lub korepresor
MODEL OPERONU
Dwa fragmenty odległe
1. fragment regulatorowy – promotor, geny regulatorowe – element regulacyjny związany z aktywowaniem genów transkrypcja genów translacjarepresor (związane z aktywnością całego operonu – białka konstytutywne)
2. geny struktury – kodują określone enzymy (albo szlaku katabolicznego, albo anabolicznego); ułożone one są ściśle jeden obok drugiego, są regulowane jako całość, ich aktywność jest regulowana jednostkowo; przy pierwszym genie struktury operator; obok niego promotor – miejsce przyłączenia enzymu. Operator jest miejscem regulatorowym – do niego jest przyłączane bądź odłączane białko represora (w zależności od typu operonu przyłączenie represora albo zablokuje, albo umożliwi transkrypcję) Przyłączenie bądź odłączenie jest uzależnione od stężenie substancji substratu lub produktu
OPERON LAC – kataboliczny, INDUKOWALNY
Jeżeli nie ma laktozy obecnej w otoczeniu, wtedy geny związane z transportem i metabolizmem nie są transkrybowane. Glukoza też wpływa na transport laktozy, ponieważ wpływa na stężenie cyklicznego AMP (cAMP). cAMP jest czynnikiem regulującym operon laktozowy. Jeżeli laktoza jest w komórce to obniża się poziom cAMP. Jeżeli nie ma ekspresji tych genów, to nie ma też permeazy galaktozydowej, która odpowiada za transport laktozy.
Aktywny: brak glukozy, obecność laktozy.
Białko regulatorowe w momencie kiedy jest w cytoplazmie (białko konstytutywne) łączy się z operonem laktozowym i nie ma ekspresji genów. Gdy pojawia się laktoza i nie ma glukozy w podłożu to laktoza łączy się z tym represorem, zmienia się jego konformacja przestrzenna i nie blokuje operonu. Dodatkowo białko nośnikowe CRP łączy się z cAMP i umożliwia działanie polimerazy RNA i transkrypcję genów operonu
Regulacja biosyntezy białek – operon LAC – metabolizm laktozy – hydroliza do galaktozy i glukozy, włączany dopiero po zmetabolizowaniu glukozy – represja kataboliczna – obniżanie stężenia cAMP
OPERON ANABOLICZNY, HAMOWANY – syntezowane enzymy związane z syntezowaniem określonych produktów
Białko konstytutywne ciągle obecne w komórce – jest ono nieaktywne, nie łączy się z promotorem i operatorem. Geny struktury są transkrybowane, powstają enzymy, które biorą udział w syntezie np. tryptofanu. Gdy wzrasta stężenie tryptofanu, białko represorowe łączy się z produktem szlaku (jest on inhibitorem) i łączy się z operonem, blokując transkrypcję genów operonowych
Kontrola aktywności białek już zsyntezowanych – sprzężenie zwrotne – enzymy allosteryczne – REGULACJA AKTYWNOŚCI BIAŁEK, A NIE ICH SYNTEZY
Jest to regulacja najczęściej regulowana przez produkt (jest on allosterycznym efektorem – czynnikiem zmieniającym aktywność enzymu). Enzym allosteryczne – ma dwa miejsca wiążące: substrat i w tym przypadku produkt (miejsce allosteryczne).
KOWALENCYJNA MODYFIKACJA PRZEZ INNE ENZYMY. RÓWNOWAGA STANÓW: AKTYWNY:NIEAKTYWNE
Biorą udział inne enzymy (reakcja katalizowana enzymatycznie) – przyłączanie reszty np. adenylowej odbywa się przy udziale enzymu.
Np. SYNTETAZA GLUTAMINY – enzym ważny dla gospodarki azotu, jedyny enzym, mogący włączać azot w postaci amonowej do cząsteczki glutaminy, może korzystać z donora nieorganicznego. Aby go zdezaktywować zużywa się 12 ATP (wskazuje to, że jest to kluczowe białko). Modyfikacja chemiczna przy deaktywacji zmienia też konformację przestrzenną cząsteczki.
NIERYBOSOMALNA IBOSYNTEZA BIAŁEK (krótkie polipeptydy)
Np. cykliczne antybiotyki peptydowe lub Gramicydyna S – jonofor u B. brevis (kanały jonowe, ten związany z transportem kationów).
Aminokwasy powstałe w tym procesie mogą mieć konformacją D.
Enzym odpowiedzlany tylko za aktywację pentapeptydu.
Najpierw aktywowanie aminokwasu z ATP przy udziale enzymu. Powstaje kompleks Aminoacyloadenylo-E i powstaje Aminoacylo-E (aminoacylo enzym)
Następnie dołączanie kolejnych aminokwasów (kolejne enzymy łączące się tylko z określonymi aminokwasami), ostatecznie powstaje pentapeptyd z oboma enzymami na końcach – wtedy może dojść do cyklizacji.
Gramicidina A – JONOFOR W CYTOPLAZMIE
Bardzo często są to złożone układy wielopodjednostkowe
Actinomycina D