GENETYKA BAKTERII
Jest bardziej złożona, bakterie mogą podlegać zmianą, ale zachodzi to drogą innych procesów niż replikacja
PODSTAWOWE POJĘCIA
Genotyp
Fenotyp
Typ dziki – występujący naturalnie
Mutant – powstały w wyniku mutacji – hodowla bakterii (klonu lub szczepu)
Adaptacja fenotypowa – do zmian środowiska, dotyczy wszystkich komórek (nie mutantów); zmiany metabolizmu zależne od środowiska w obrębie materiału genetycznego zawieranego przez bakterie – zmienia się na tyle, na ile pozwala jej genotyp (np. przy braku tlenu niektóre mogą przejść na metabolizm beztlenowy – mogą to być zatem zmiany w szerokim zakresie)
Zmiana genotypowa - kilka komórek, selektywnie preferowanych; dochodzi wtedy, gdy dojdzie do mutacji i ta mutacja powoduje, że komórki mają przewagę w danym środowisku
Fenotyp u bakterii to typ procesów metabolicznych
MUTACJE
Ukierunkowane – ściśle zaplanowany, zdefiniowany efekt (określone miejsce, zaplanowany efekt, może być racjonalnie zaprojektowane)
Nieukierunkowane – ogólne, trudno przewidzieć rezultat; zachodzą bez projektowania, planu działania, eksperymentów, nie wiadomo gdzie zajdzie mutacja; zachodzą najczęściej miedzy bakteriami ściśle ze sobą spokrewnionymi – musi być długi obszar homologii materiału genetycznego.
Gen – daje w efekcie jeden polipeptyd lub łańcuch RNA
MUTACJE
Mutacja – trwała zmiana w DNA – dziedziczona
Mutacje:
a) letalne – nie jest zmiana dziedziczna;) ; komórka nie może przetrwać w wyniku mutacji
b) warunkowo – letalne (auksotrofy; auksotrofia – typ mutacji) – auksotrofy – bakterie o zmienionych wymaganiach pokarmowych, mutanty (bakteria, która do swojego wzrostu będzie wymagała określonych związków; np. względem witamin (np. B12), azotu, czy aminokwasów); mogą rosnąć na podłożach minimalnych nawet bez dodatku tego składnika – będą rosły jednak tylko do pewnego momentu, nie dzielą się one i przetrwają dopóki przetrwają komórki, które przenieśliśmy (przetrwają tyle, ile czas generacji)
c) ciche – zmiany trwałe, nie ujawniają się fenotypowo, są przenoszone
SZYBKOŚĆ MUTACJI = CZĘSTOTLIWOŚĆ
Spontaniczne, różne
REWERSJA –REWERTANTY – powrót do fenotypu sprzed mutacji, powrót do fenotypu wyjściowego:
a) prawdziwe – zniwelowana mutacja, dokładna zamiana miejsca w którym zaszła mutacja na DNA, które było tam wcześniej, powrót do DNA wyjściowego (typu dzikiego, sprzed mutacji)
b) funkcjonalne – przywrócenie dzikiego fenotypu z zachowaniem pierwotnej mutacji, np. poprzez alternatywny szlak metaboliczny (brak zmian w materiale genetycznym; odpowiedni szlak umożliwia obejście tej mutacji, niweluje skutek mutacji)
c) supresorowe – inna mutacja, eliminuje pierwotną; chodzi o produkty genów, najczęściej enzymy, eliminują skutki wcześniejszej mutacji
MUTACJE
Wyłącznie punktowe (bo występuje tylko jeden chromosom bakteryjny):
addycja; delecja; substytucja
Czynniki mutagenne i sposoby ich działania
Bromouracyl – wywołuje zmiany DNA u eukariota i prokariota
Kwas azotawy HNO2
Oranż akrydynowy – ma zdolność wbudowywania się w cząsteczkę DNA (jej średnia pasuje w srednicę nukleotydów)
Promieniowanie UV
Promieniowanie X
BROMOURACYL
Bromouracyl jest analogiem Tyminy (może występować w formie ketonowej i enolowej; w formie ketonowej to nie ma problemu; ale gdy w postaci enolowej – ma zdolność do utworzenia 3 wiązań wodorowych – nastąpi zamiana układu tymina – adenina na cytozyna – guanina)
KWAS AZOTAWY
Bardzo silny utleniacz – powoduje oksydatywną deaminacji – usuwanie grupy aminowej z jednoczesnym procesem utleniania; Adenina z grupą aminową – mogła tworzyć wiązania wodorowe (czynnik + dla wodoru i ujemna dla N) – po deaminacji może dojść jedynie do jednego typu wiązania wodorowego; ponownie zamiana pary AT na GC. Podobnie może zajść deaminacja w C i wtedy CG zamienia się na AT po replikacji.
PROMIENIOWANIA UV
Parowanie tyminy – tworzenie kowalencyjnego wiązania między sąsiadującymi nukleotydami; powstaje układ nieprawidłowy – wiązanie kowalencyjne (a nie fosfodiestrowe); możliwe tylko wtedy, gdy sąsiadujące TT.
SYSTEMY NAPRAWCZE DNA
Fotoreaktywacja – naprawa zależna od światła – enzym aktywowany przez światło – ten sam czynnik, który wywołuje mutację, jest czynnikiem wywołującym naprawę; jest skierowany wyłącznie do mutacji wywoływanej przez UV; dimer TT jest rozłączany jednoenzymatycznie – rozkładane jest jedno wiązanie, które jest przyczyną mutacji – nic nie jest wycinane
Naprawa niezależna od światła – jeżeli dojdzie do mutacji w bardzo wielu miejscach, musi być aktywowany układ kilku enzymów: endonukleazy (rozkładają wiązanie wewnątrz DNA, tam gdzie mutacja) – skutek dwie długie fragmenty DNA; egzonuklezy (usuwanie fragmentu DNA); polimeraza DNA (dołącza poprawne nukleotydy); ligaza DNA (łączy nowe nukleotydy z łańcuchem)
NAPRAWA DNA
MECHANIZM SOS – wywołany – mechanizm totalny, zaburzeniu ulegają wszystkie procesy metaboliczne, hydrolizowane wszystkie białka; komórka bakteryjna może go nie przeżyć:
Obecnością fagów łagodnych
Silną mutacją
Zahamowaniem replikacji
Reakcja komórki:
Spadek procesów oddechowych – zahamowane procesy utleniania
Rozpad białek – hydroliza – też białka strukturalne
Indukcja enzymów naprawczych
Biosynteza białek regulatorowych: Rec A; Lex A
Rec A:
1. hamuje replikację – przyłącza się do nici DNA
2. aktywność hydrolityczna (niska specyficzność) – hydrolizuje inne białka niespecyficznie (białka nieprawidłowe czy obce i własne)
Lex A – represor transkrypcji genów związanych z odpowiedzią SOS; blokuje promotory genów białek związanych z odpowiedzią SOS
Koniec: proteoliza Lex A z udziałem Rec A
IZOLACJA MUTANTÓW
Ekspozycja na mutagen (bardzo proste, wystawić pod lampę UV)
Usunięcie komórek, które nie uległy mutacji (bardzo trudne; największy problem)
Izolacja, namnożenie (nie jest aż tak skomplikowane; można hodować na podłożu pełnym i na pewno sobie wyrosną)
METODA ROZDZIELANIA
Auksotrofy – nie rosną na minimalnych podłożach.
Hodowla poddana mutacji
Prototrofy będą rosły na podłożu minimalnym
Jeśli do podłoża minimalnego doda się penicyliny (będzie to czynnik selektywny) – zabije tylko te organizmy, które mogą się dzielić, czyli prototrofy (dzikie typy bakterii, które nie uległy mutacji); przy życiu zostaną auksotrofy (te zmutowane) (nie zostaną zabite, bo się nie dzielą i nie tworzą ściany komórkowej – czynnik inicjujący penicylinę)
Wykonano posiew – podłoże pełne ze wszystkimi składnikami. Hodowla wyjściowa jest odpowiednio rozcieńczona – zmniejszenie liczby komórek na płytce. Odciska się płytkę (hodowle bakteryjne) na replikatorze; potem odciska się to na innych podłożach (mineralnych – tam wyrośnie prototroficzna, z odpowiedniego kwadratu płytki); potem np. podłoże z tryptofanem (tam auksotrofy zależne od tryptofanu), potem np. z argininą.
W ten sposób można odizolować mutanty.
REKOMBINACJE GENETYCZNE – TRANSFERY DNA
Dawca; biorca
TYPY ZMIENNOŚCI (NIE MA NIC WSPÓLNEGO Z ROZMNAŻANIEM):
Transformacja – wolne DNA z otoczenia; najczęściej mamy komórkę, która jest dawcą i biorcą (tutaj dawca najczęściej jest komórką martwą)
Koniugacja
Transdukcja
1. REKOMBINACJA OGÓLNA – HOMOLOGICZNA – DŁUGI OBSZAR HOMOLOGII; nici ustawiają się na zasadzie komplementarności i może dojść do rekombinacji; występuje u organizmów blisko ze sobą spokrewnionych
2. REKOMBINACJA ZLOKALIZOWANA – włączenie materiału genetycznego w ściśle określonym miejscu; krótki obszar homologii pasujący do materiału genetycznego, do którego będzie włączany – organizmy nie muszą być ze sobą spokrewnione (np. bakteriofag typu lambda i E. coli)
TRANSFORMACJA
Zaobserwowano u Streptococcus pnaeumaniae G(+) – mogą żyć w dwóch odmianach: bezotoczkowej (r – szorstki) i otoczone śluzową otoczką (s). śluzowa otoczka warunkuje patogenność. Zabijano temperaturą szczep S, następnie wprowadzono szczep R; mysz zainfekowana taką mieszanka przejawia objawy choroby (szczep R przejmuje patogenność ze szczepu S)
TRANSFORMACJE U BAKTERII G(+)
1. Inicjacja – synteza czynnika kompetencji; większość bakterii gotowych do zmian genetycznych to bakterie w tzw. stanie kompetencji Czynniki białkowe aktywują: nukleazy, białka wiążące DNA oraz autolizyny – odsłania zewnętrzne odsłony komórki i receptory dla dsDNA; białko wiążące znajduje się na powierzchni komórki bakteryjnej
2. Choć receptor wiążą dsDNA to do wnętrza wnika ssDNA (jest zewnętrznie hydrolizowana; dsDNA nie wnika do wnętrza komórki); DNA jest cięty i jedna nić jest degradowana przez nukleazę a druga wnika do komórki
3. Między nową nicią a genomem zachodzi rekombinacja
TRANSFORMACJA
U G(-)
Np. Haemophilus influenze – wywołuje objawy grypopodobne
Komórki muszą być w stanie kompetencji
11 par zasad warunkujących homologię – może być kilka obszarów homologii; w przypadku transformacji bakterie spokrewnione; do wnętrza komórki dostaje się dsDNA, w cytoplazmie już jako ssDNA jest włączany w genom. Taka bakteria daje początek kolejnej linii komórek bakteryjnych.
Sztuczne transformacje – u E. coli – utraciły naturalną zdolność pobierania DNA
Komórki są wprowadzane w stan kompetencji: do roztworu dodaje się jonów Ca2+, 0st.C – na 24h; po tym otrzymuje się struktury sferyczne, następnie 90 sekundowe ogrzewanie w 40st.C – następuje proces transformacji
Warunki - DNA musi być samoreplikujący się, żeby był pobrany do wnętrza komórki
Jest to typ transformacji kluczowy dla klonowania genów
PRZYKŁADY SZCZEPÓW ZDOLNE DO TRANSFORMACJI:
G(+)
Streptococcus pneumoniae i Bacillus subtilis – kluczowe
G(-)
Naturalnie transformacje: Haenophilus influenzę i szczepy z rodzaju Pseudomonas
Sztuczne: E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimotium
KONIUGACJA – JEDNOKIERUNKOWY PRZEPŁYW DNA
Musza uczestniczyć 2 komórki bakteryjne; w przypadku transdukcji pośrednikiem był wirus; w przypadku transformacji wolne DNA
Kanałem przez który pobierany jest materiału genetyczny są pille bakteryjne (zbudowane z białka pilliny). Pilus płciowy oznacza się symbolem F. Początkowy pilus płciowy jest bardzo długi. Poszczególne monomery oddysocjowują i bakterie się do siebie zbliżają. Zachodzi przekazanie materiału genetycznego. Dawcą jest określona komórka męska; przekazywane jest dsDNA.
PLAZMIDY, EPISOMY
Episom (pojęcie szersze) – pozachromosomalne DNA włączone w genom gospodarza lub wolne (plazmid – replikon; zdolny do samoreplikacji, niezależnie od genomu bakteryjnego); po koniugacji obie bakterie są bakteriami męskimi
Cechy:
Liczba kopii
Amplifikacja (powielenie liczby plazmidów w komórce) wymaga obecności białek stałych, biorących udział w replikacji genomu
Niezgodność – w jednej komórce nie mogą koegzystować blisko spokrewnione plazmidy – plazmidy, których sekwencja pokrywa się w mniej więcej 50% lub więcej; są pewne fragmenty na plazmidzie, których ekspresja powoduje, że blokowane jest przyjmowanie plazmidów bliskospokrewnionych
Zakres gospodarzy:
1. Wąski – najpowszechniejsze; generalnie w obrębie gatunku najczęściej; rzecz dla nas korzystna
2. Szeroki – niestety też pewne typy plazmidów mają szeroki zakres gospodarzy:
a) RP4 – koniugacyjny – warunkuje oporność na apicylinę, kanamycynę i tetracyklinę
b) RSF1010 – niekoniugacyjny – warunkuje oporność na streptomycynę i sulfonamidy; aktywny tylko w tej komórce, która go posiada
NIEZALEŻNA REPLIKACJA PLAZMIDÓW
Liczba kopii zależy tylko i wyłącznie od cech charakterystycznych plazmidów; nie od ilości genomu bakteryjnego DNA
Selektywny czynnik, który blokuje replikację plazmidów jest oranż akrydynowy – zmienia on ramkę odczytu; jego rozmiar świetnie pasuje do średnicy helisy i interkaluje z materiałem plazmidów w ściśle określonym miejscu: oriT – w początku miejsca replikacyjnego plazmidu
PLAZMID – kilka cech, które musi spełniać, aby był cyznnikiem koniugacyjnym
Region ori T – musi dojść do hydrolizy jednej z nici i pojedyncza nić jest przekazywana dalej
Region mob – mobilizacji; musi ulec ten fragment ekspresji – powstają białka; komórka jest kompetentna, gotowa do wymiany materiału genetycznego
Inc – fragment, który jest fragmentem inkorporacyjnym (wprowadzenie materiału genetycznego do fragmentu biorcy
Iterony – sekwencja, do której przyłączają się białka inicjujące samorepllikację
Tra – 13 genów
PLAZMIDY KONIUGACYJNE (REGION TRA)
Escherichia coli
Bacillus
Clostridium
Nocardia
Staphylococcus
Enterococcus
Streptomyces
F – plazmid koniugacyjny – płodności
F+ – dawca męski; zawierająca plazmid
F – biorca żeński; plazmidu nie zawiera
REPLIKACJA PLAZMIDU – model toczącego się koła (inny rodzaj replikacji, niż w przypadku normalnej replikacji, która powoduje zwykłe zwiększenie kopii)
Efektem tego jest to, że powstają 2 komórki F+
RÓŻNE TYPY PŁCIOWE U E. COLI
Komórka F+ (z plazmidem) – może ona być źródłem plazmidu dla komórki F-; może też dojść do rekombinacji plazmidu z materiałem genetycznym – otrzymujemy Hfr; następnie od Hfr może dojść do: prawidłowego wycięcia plazmidu – otrzymujemy F+; może też dojść do wycięcia nieprecyzyjnego – mamy plazmid z fragmentem genomu i genom z fragmentem plazmidu – jest to F’, a plazmid to czynnik F’; jeśli taka komórka F’ będzie koniugowała z komórką F- dojdzie do tego, że plazmid z fragmentem genomu zostanie przeniesiony do F- będzie miała podwojoną część genów – otrzymamy częściową diploidalność względem określonego fragmentu DNA – merozygotę; oprócz tego z komórki Hfr może dojść do przekazania materiału genetycznego całego genomu do komórki bakterii biorcy – komórka dawcy nie zostaje jednak bez genomu – model toczącego się koła (w naturze bardzo rzadko, ale sztucznie już tak)
GENETYKA BAKTERII
KONIUGACJA Hfr i F-
Po 100 minutach w określonych warunkach może dojść do przeniesienia całego genomu komórki bakteryjnej; stwierdzono to na podstawie badania fenotypu bakterii – sprawdzano, które produkty występują w większym stężeniu;
MOBILIZACJA PLAZMIDÓW – plazmidy niekoniugacyjne mogą być przekazywane przy udziale pomocniczych plazmidów koniugacyjnych. Jako osobna cząsteczka (gdy po rekombinacji z koniugacyjnym zyska fragmenty, które umożliwiają koniugację) lub jako kointegrat dwóch plazmidów (koniugacyjnego i niekoniugacyjnego), które ulegają rozpadowi w komórce biorcy, mogą jednak też występować w postaci całej cząsteczki.
TYPY PLAZMIDÓW:
Determinanta r – plazmid niekoniugacyjny, który niesie oporność na antybiotyki
RTF – czynnik przenoszenie transferowy – plazmid koniugacyjny, wrażliwy na antybiotyki.
Po dojściu do rekombinacji takich plazmidów i rekombinacji z F- otrzymujemy obie komórki oporne
BAKTERIOCYNY – związki antybakteryjne – białka, zabijają lub hamują wzrost blisko spokrewnionych bakterii. Najczęściej hamują transport, kanały transportowe związane z transportem cukrów, glukozy, hamują również transport jonów, np. żelaza. (chodzi o konkurencję, zasoby środowiska); zjawisko bardzo istotne – flora bakteryjna w układzie pokarmowym czy oddechowym wydziela bakteriocyny i zabija inne bakterie; u zdrowego człowieka nie dochodzi do zarażenia salmonellą, ponieważ mamy kolicyny wydzielane przez E. coli
Kolicyny – produkowane przez E. coli i blisko spokrewnione bakterie – kodowane przez col plazmidy
Piocyny – produkowane przez Pseudomonas aeruginosa
Megacyny – bacillus megaterium