Ćwiczenia (3)

Badanie bakteriologiczne mleka

Część 1- zasady badania

Cel badania:

-stwierdzenie ewentualnej obecności drobnoustrojów chorobotwórczych

-określenie stopnia ilościowego występowania mikroflory saprofitycznej, decydującej o przydatności do przetwórstwa i trwałości mleka

-określenie stanów sanitarnych produkcji, przechowywania i obrotu

Podstawa prawna:

-ustawa z dnia 16 grudnia 2005r. o produktach pochodzenia zwierzęcego

-rozporządzenie parlamentu i rady nr 853/2004 z dnia 29 kwietnia 2004r. ustanawiające szczególnie przepisy dotyczące higieny w odniesieniu do żywności pochodzenia zwierzęcego

-rozp 854/2004

-rozp 2073/2005 w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych

Pobieranie próbek

-PN-EN ISO 707:2009 Mleko i przetwory mleczne- wytyczne do pobierania próbek

-normy są to instrukcje, jak co należy zrobić

-pobieranie powinno być poprzedzone mieszaniem

-jałowość

-reprezentatywność

-pierwszeństwo w trakcie pobierania

-zakaz konserwacji

-min. 100ml(g)

- 1-5C do 24h(jak najszybciej)

Próbka laboratoryjna- pobrana próbka przeznaczona do wysyłki co badań

Próbka analityczna- pobrana z p. labor.

Określenie jakości higienicznej mleka

-metody orientacyjne(jakościowe)- oparte na zdolności bakterii do redukcji określonych substancji

-metody ilościowe (oznaczanie o.l.b w 1ml mleka):

-metoda płytkowa(odwoławcza)

-uproszczona metoda płytkowa

-test Petrifilm- wg. instrukcji producenta

-metody instrumentalne- BactoScan, BacTrac

Metoda orientacyjna

PN-A-86036:1998 Mleko surowe do skupu- badania mikrobiologiczne i cytologiczne

Metoda orientacyjna z użyciem chlorku trójfenylotetrazolowego(TTC)

-zasada oznaczania: oznaczanie oparte jest na zdolności bakterii obecnych w mleku do redukcji TTC. Czas, po jakim następuje redukcja TCC, a tym samym zaróżowienie mleka z dodaną pożywką i odczynnikiem, jest proporcjonalny do liczby bakterii.

Ogólna liczba drobnoustrojów w 1ml mleka(jkt/ml) / czas redukcji TTC (h)

<100 000/ >23

<400000 / <23

<1000 000/ <20

Metoda płytkowa(odwoławcza)

-PN-EN ISO 7218:2008 Mikrobiologia żywności i pasz- wymagania ogólne i zasady badań mikrobiologicznych

-PE-EN ISO 4833:2004 Mikrobiologia żywności i pasz- horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów- metoda płytkowa w temp 30C

Przygotowanie próbek i rozcieńczeń

PE-EN ISO6687-1:2000

Mikrobiologia żywności i pasz

Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych

Ogólne zasady przygotowania zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych

(stan sanitarny mleka)(metoda płytkowa)(ogólna liczba bakterii tlenowych w temp 30C przez 72h)

-posiew na podłoże agarowe

-przez wykonaniem posiewy wykonujemy rozcieńczenie

(mleko<ml>, płyn fizjologiczny,

90ml płynu przenosimy 10ml produktu- mleka=> pierwsze rozcieńczenie 10^-1

9ml płynu pobieramy z pierwszego rozcieńczenia 1ml =>rozcieńczenie 10^-2

Itp, za każdym razem zmieniamy końcówkę pipety, za każdym razem mieszamy

Posiew: metodą wgłębną lub powierzchniową

-na podłoże stałe agarowe

Posiew powierzchniowy: płytki wylane agarem, na każde rozcieńczenie potrzeba 2 płytki

Z każdego rozcieńczenia pobieramy 0,1ml (może być inna ilość ale trzeba to uwzględnić we wzorze)

Nakrapiamy na podłoże, głaszczką wykonujemy rozmaz, i do cieplarki 30C przez 72h

Posiew wgłębny: na pustą płytkę petriego nanosimy 1ml rozcieńczenia, zalewamy agarem płynnym o temp 40C, mieszamy, czekamy az agar wyschnie i do cieplarki 30C przez 72h

Liczmy pojedyncze kolonie, przy zlewnym wzroście liczmy jako pojedyncze ale na powierzchni mniejszej niż 1/4płytki. Jeżeli zlewny wzrost na więcej niż ¼ to płytkę odrzucamy. Tylko te gdzie będzie mniej niż 300 koloni

Sumujemy dwie płytki z danego rozcieńczenia i wyciągamy średnią

N= suma C/ V x 1,1, x d

Gdzie:

N- liczba drobnoustrojów występujących w badanej próbce

Suma C- suma koloni na wszystkich płytkach z dwóch kolejnych rozcieńczeń, z których co najmniej jedna zwiera minimum 10 kolonii

V-objętość materiału naniesionego na każdą płytkę, w mililitrach

d- wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu liczonemu rozcieńczeniu

Przykład

- w pierwszym rozcieńczeniu 10^-2 uzyskano: 168 koloni

-w drugim rozcieńczeniu 10^-3 uzyskano 14 koloni

N= 168+14/ 1 x 1,1 x 10^-2 = 182/ 0,011= 16 545

Po zaokrągleniu wyników, liczba drobnoustrojów w mililitrze lub gramie produktu wyniesie 17 000 lub 1,7 x 10^4

PE-EN ISO 6579:2003

Mikrobiologia żywności i pasz

Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp.

Schemat izolacji pałeczek rodzaju salmonella

1. przednamnażanie

próbka (25g lub ml) + 225 ml zbuforowanej wody peptonowej o temp otoczenia

inkubacja 37C 18h

2. namnażanie selektywne

- 0,1 ml hodowli + 10ml pożywki Rapaport-Vasiliaris (RVS)

Inkubacja 41,5C 24h

-1ml hodowli + 10ml pożywki Muller-Kauffmanna z czterotionianem i nowobiocyną (MKTTn)

Inkubacja 37C 24h

3. przesiew na stałe pożywki selektywne

-pożywka XLD

-do wyboru np.: SS lub BPLS lub Hektoena lub z siarczanem bizmutawym

Inkubacja 37C 24h

4. potwierdzenie

Selekcja 5 charakterystycznych koloni z każdej płytki

Przesiew na agar odżywczy

Inkubacja 37C 24h

1. Badania biochemiczne(TSI), VP, ureaza, lizyna, indol, Beta-galaktozydaza

2. Badania serologiczne (antygeny O, Vi, H)

5. Interpretacja wyników

Schemat izolacji gronkowców

PE_EN ISO 6888-1:2001

Mikrobiologia żywności i pasz

Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (S. aureus i innych)

Część 1: metoda z zastosowaniem pożywki agarowej Baird-Parkera

PE_EN ISO 6888-2:2001

Cześć 2: metoda z zastosowaniem pożywki agarowej z plazmą króliczą i fibrynogenem

Schemat izolacji gronkowców

Posiew po 1ml ( z każdego rozcieńczenia) do 3 probówek z 9ml podłoża Giolicyli- cantoni

(G-C), zalanie podłoża 2-3cm warstwą upłynnionego agaru. Inkubacja w 37C przez 24h-48h

Posiew 1 kropli materiału z dna probówki z podłoża G-C wykazującego wzrost gronkowców(szary lub czarny osad lub zaczernienie całego podłoża) na podłoże Baird-parkera

Inkubacja 37C przez 24-48h (pierwsze sprawdzanie posiewów juz po 24h)

Posiew 5 podejrzanych koloni(czarne, często ze stalowym odcieniem, okrągłe kolonie, najczęściej z wąskim, przezroczystym brzegiem: szczepy wytwarzające lipazę tworzą kolonie otoczone matową lub przejrzystą strefą zmienionej pożywki)przesiewamy na pożywkę z wyciągiem mózgowo-sercowym(BHI)

Inkubacja 37C/ 24h

Ewentualne próby na zdolność wytwarzania katalazy i fermentację glukozy w warunkach beztlenowych

!! Próba na zdolność wytwarzania koagulazy: 0,3ml plazmy króliczej + 0,1 ml hodowli na BHI-> inkubacja w 37C do 6h. Wynik dodatni objętość skrzepu wynosi więcej niż połowę wyjściowej objętości płynu.

Wskaźniki sanitarne żywności:

-liczba bakterii z rodziny Enterobacteriaceae

-liczba pałeczek E.coli

-bakterie z grupy coli

-enterokoki (paciorkowce kałowe)

Enterobacteriaceae

-PN-A

3

---