α-Galaktozydaza (galaktohydrolaza -D-galaktozydów; EC 3.2.1.22) katalizuje reakcję hydrolizy końcowych reszt -D-galaktopiranozy w -D-galaktozydach. Oddziałuje ona na oligosacharydy zawierające galaktozę (np. melibiozę, rafinozę czy stachylozę), galaktolipidy i galaktoglukomannany. Wykazuje aktywność transfer azową katalizując syntezę oligosacharydów podczas inkubacji z odpowiednio wysokimi stężeniami monosacharydów. Enzym pochodzenia mikrobiologicznego charakteryzuje się wąską specyficznością substratową. Znajduje zastosowanie w przemyśle spożywczym, cukrowniczym do enzymatycznej degradacji rafinozy oraz do hydrolizy oligosacharydów zawierających wiązania α-D-galaktozydowe które występują w nasionach roślin strączkowych i powodują wzdęcia po ich spożyciu. Może być wykorzystany do redukcji zawartości galaktozy w galaktomannanie- środku żelującym (przemysł kosmetyczny, farmaceutycznym spożywczy). Można z jej udziałem z rafinozy otrzymać słodzik sukralozę a także heterogeniczne rozgałęzione cyklodekstryny w których reszty galaktozy tworzą boczne łańcuchy. Te oligosacharydy są stosowane jako stabilizatory pochłaniaczy zapachów. Substancję produkują mikroorganizmy: Aspergillus awamori, Aspergillus saitoi, Mortierella vinacea, Cincinellasp.,Absidia sp., Saccharomyces carsbergenis, Penicillium canescens itp. Większość mikroorg zawiera wewnątrzkomórkową α-Galaktozydazę, lecz pleśnie rodzaju Aspergillus, Penicillium i bakterie Bacillus stearothermophilus wytwarzają ją pozakomórkowo. Grzyby nitkowate w tym Mortierella vinacea IBT-3 syntetyzujące enzymy wewnątrzkom, rosną w postaci sferycznych kolonii. Aktywność α-galaktozydazy

E – absorbancja przy λ=405nm

R – rozcieńczenie

2 – ponieważ do reakcji wzięte zostało 0,5 ml enzymu

0,076 – współczynnik przeliczeniowy z krzywej wzorcowej

15 – czas reakcji enzymatycznej

m – masa grzybni

Pektyny są głównym składnikiem wiążącym w ścianach komórkowych roślin i owoców. W materiale roślinnym pektyny występują w połączeniu z celulozą i takie substancje są nazywane protopektyną, która tworzy lepiszcze ścian komórkowych. Chemicznie są polisacharydami o strukturze liniowej utworzonej z połączonych cząsteczek kwasu galakturonowego.

Pektyny mają zdolność wytwarzania żeli w obecności cukru. Z tego powodu pektyny, w połączeniu z cukrem, są używane w przemyśle spożywczym jako środek zagęszczający. Najpowszechniej znane zastosowanie pektyn to wykorzystanie ich w produkcji dżemów. Większość owoców zawiera pektyny ale w ilości nie wystarczającej do wytworzenia mocnego żelu, dlatego dla poprawy jakości produkowanych dżemów są one dodawane. Pektyny są dodawane do specjalnego cukru, który jest przede wszystkim używany do produkcji dżemów (cukier żelujący). Wyróżnia się dwie frakcje pektyn, w zależności od stopnia estryfikacji:

• wysokometylowane WM (inaczej wysokoestryfikowane WE), w których zestryfikowanych jest >50% grup karboksylowych reszt kwasu galakturonowego;

• niskometylowane NM (inaczej niskoestryfikowane NE), w których stopień estryfikacji jest mniejszy od 50%.

Kwas poligalakturonowy jest substancją, zbudowaną z większej liczby cząsteczek kwasu rf galakturonowego, w sposób podobny , jak skrobia zbudowana jest z cząsteczek d-glukozy.

Pomiar spadku lepkości ekstraktu w trakcie hydrolizy pektyn: wiskozymetr Oswalda wstawiono do łaźni wodnej o temperaturze 20^oC napełniono 15 cm³ wody destylowanej i zmierzono czas jej wpływu. Następnie do wiskozymetru wlewano 15 cm³ kolejno opisanych niżej roztworów i po wyrównaniu temperatury mierzono czas wpływu roztworów.

Oblicz całkowity koszt hydrolizy 10m³ roztworu pektyny, jeżeli preparatu enzymatycznego kosztuje 100zł (preparat był rozcieńczony 600 razy). Koszt podgrzania 10m³ pektyny o 1°C wznosi 5 zł. Wyznacz optymalny koszt hydrolizy 10m³ pektyny, przyjmując, że temperatura wyjściowa wynosiła 10°C.

Koszta całkowity [zł] można obliczyć ze wzoru ogólnego:

10m³ = 10⁷cm³

a) Obliczenia dla temp. 20^oC:

Spadek lepkości 13 ml pektyn do 40% w podanych warunkach temperaturowych nastąpił po zastosowaniu 1,90 ml enzymu. Skoro:

13 ml pektyn - 1,9 ml enzymu

10⁷ml pektyn - x ml enzymu

x= 1,46 x 10⁶ ml enzymu

Zważywszy na to ,że stosowany przez nas enzym był 600-krotnie rozcieńczony, pierwotną objętość niezbędnego do hydrolizy enzymu obliczyć można ze wzoru:

Wiedząc, że 1 litr nie rozcieńczonego enzymu kosztuje 100 zł ,obliczyć można koszt potrzebnego enzymu:

1000 ml enzymu - 100 zł

2435,8 ml enzymu - y

y= 243,58 zł

Koszt podgrzania pektyny:

Skrobia jest podstawowym materiałem zapasowym występujących w roślinach, głownie w ziarnach zboż, liściach, łodygach czy bulwach ziemniakow. Ma ona postać biały ziaren, ktore nie rozpuszczają się w wodzie i bardzo wolno rozkładana przez drobnoustroje. W gorącej wodzie skrobia pęcznieje, traci swoją jednorodną postać i zaczyna się żelować temperaturze

120-130°C skrobia rozpuszcza się całkowicie. Upłynniona skrobia znajduje zastosowanie przy hodowli mikroorganizmow ( jest dobrym źrodłem węgla). Ten polimer glukozy jest rownież stosowany, jako surowiec w produkcji bioetanolu. Tworzy dwie frakcje: amylozy i amylopektyny. W amylozie występują wiązania α-1,4 glikozydowe, ktore nie tworzą rozgałęzień łańcucha. Natomiast w amylopektynie poza wiązaniami α-1,4 glikozydowymi występują wiązania tzw. rozgałęziające, czyli α-1,6 glikozydowe. Aby zdegradować (zhydrolizować) skrobie można zakwasić bądź zalkalizować środowisko, bądź użyć w tym celu enzymow. Proces hydrolizy dzeili się na 2 etapy. Pierwszy z nich obejmuje upłynnianie, podczas ktorego dochodzi do rozkładu skrobi do dekstryn, niewielkioej ilości glukozy i, krotkich cukrow. Drugim etapie jest scukrzanie, polegające na rozkładzie wcześniej powstałych cukrowcow do glukozy. Enzymy rozkładające skrobię zaliczane są do grupy hydrolaz, spośród których karbohydratazy katalizują rozpad węglowodanów. Karbohydratazy dzielą się na polisacharazy i glikozydazy. Do polisacharydaz zalicza się enzymy amylolityczne: alfa i beta amylazę. Obydwa enzymy działają razem na skrobię, katalizując jej przemianę do maltozy. Beta amylaza rozkłada łańcuch reszt glukozowych do końca niealdehydowego w ten sposób ze pęka co drugie wiązanie glikozydowe. Enzym ten łatwo rozkłada amylozę. Podobnie działa na amylopektynę prowadząc do rozłożenia jej do wiązania alfa 1,6 w miejscu rozgałęzienia łańcuchaAlfa amylaza działa także na wiązania alfa 1,4 Początkowo enzym ten dzieli cząsteczki skrobi na stosunkowo duże fragmenty- dekstryny które dalej pod wpływem tego enzymu rozpadają się maltozę i dekstryny graniczne.

Rozpuszczono 5 g skrobi ziemniaczanej w 50 ml buforu w kolbie Erlenmayer’a (200 ml). Do roztworu skrobi dodano 1 ml rozcieńczonego (dziesięciokrotnie) preparatu enzymatycznego (α-amylazy). Następnie rozcieńczono 10 krotnie probę 0,5 ml zawiesiny z nad osadu. Pobrano 0,5 ml rozcieńczonej proby i dokonano pomiaru z DNS’em w celu sprawdzenia stężenia cukrow redukujących w probach. Erlenmayerke z roztworem skrobi umieszczono w termostacie nastawionym na 85°C na 10 minut. Po tym czasie pobrano 0,5 ml hydrolizatu i rozcieńczono 50-krotnie. Następnie dokonano pomiaru Z DNS'em na spektofotometrze. Roztwor skrobi ponownie umieszczono w termostacie na 85°C i w odstępie 15 minut pobierano 0,5 ml probę, ktorą następnie rozcieńczało się 100-krotnie i wykonywano pomiaryjak we wcześniejszych przypadkach. Przy czym po pobraniu pierwszej proby po upływie 15 minut dodano do hydrolizatu skrobi 1 ml glukoamylazy.

Aktywność dehydrogenaz glebowych jest mierzona w jednostkach odpowiadających ilości wytworzonego trifenyloformazanu przez masę pobranej gleby w czasie inkubacji. Stężenie TPF wyznaczono z krzywej wzorcowej.

Pobrać 1 g zanieczyszczonej gleby, dodać 2 ml wody destylowanej i 0,2 ml octanu acetornitrylu oraz 1,8 ml buforu tris-HCl o pH 7,5. Następnie próby inkubować w łaźni, w 30 C przez 10 minut. Po zakończeniu inkubacji próby wstawić do zamrażalnika na 10 minut. Następnie, po upływie czasu zamrażania próby wirować przez 7 minut (10 000 obr/min). Pobrać 1,5 ml próby po wirowaniu i rozcieńczyć dwukrotnie woda destylowaną. Dokonać pomiaru absorbancji przy długości fali λ=400 nm wobec próby kontrolnej zawierającej 3 ml wody destylowanej, 1,8 buforu tris-HCl oraz 0,2 ml octanu acetonitrylu.

Metoda oznaczenia aktywności katalazy polega na inkubacji próbek gleby z naturalnym substratem enzymu - nadtlenkiem wodoru. Pozostały w glebie H₂O₂, który nie został rozłożony przez katalazę, miareczkuje się roztworem nadmanganianu potasu w środowisku kwaśnym. Miarą aktywności katalazy jest ilość H₂O₂ rozłożonego przez enzymy obecne w glebie.

Pobrać 3 g gleby, dodać 2 ml 3% roztworu H₂O₂ i 10 ml buforu fosforanowego pH 7.0. Mieszaninę inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 C. Następnie próbę miareczkować roztworem nadmanganianu potasu.Aktywność katalazy wyraża się w mg H₂O₂ rozłożonego w 1 g gleby w czasie 1 godziny.