Szanowny Panie Profesorze, Szanowni Państwo: Chciałabym przedstawić państwu swoją prezentację na temat „Aminokwasów, Peptydów i Białek”.
Aminokwasy są to związki dwufunkcyjne, zawierające zarówno grupę aminową, oraz grupę karboksylową.
Aminokwasy mogą łączyć się ze sobą w długie łańcuchy przez tworzenie wiązań amidowych (zwanych również wiązaniami peptydowymi) między grupą –NH2 jednego aminokwasu i grupą –COOH innego.
Ponieważ aminokwasy zawierają zarówno grupę zasadową (czyli grupę aminową) jak i grupę kwasową (czyli grupę karboksylową), zachodzi w nich wewnątrzcząsteczkowa reakcja kwas-zasada, w wyniku czego związki te istnieją w postaci jonu obojnaczego.
Przy niskim pH w roztworze kwasowym, cząsteczka aminokwasu występuje głownie jako kation, a przy wysokim pH w roztworze zasadowym występuje jako anion. Istnieje jednak pośrednie pH, (zwane punktem izoelektrycznym) przy którym aminokwas występuje w równowadze kationowo-anionowej przyjmując postać neutralnego jonu obojnaczego i zależy on od struktury aminokwasu.
Różnice punktów izoelektrycznych można wykorzystać do rozdziału mieszaniny na czyste składniki za pomocą techniki elektroforezy. W procesie tym umieszcza się mieszaninę aminokwasów na pasku bibuły lub żelu, które zostają zwilżone wodnym roztworem buforu o danym pH. Po przyłożeniu napięcia między elektrodami umieszczonymi po bokach paska, cząsteczki aminokwasów zdeprotonowanych (o ładunku ujemnym) powoli migrują do elektrody dodatniej, a cząsteczki aminokwasów sprotonowanych (o ładunku dodatnim) migrują w kierunku elektrody ujemnej. Natomiast aminokwas w postaci jonu obojnaczego w buforze o danym pH, pozostaje na środku paska.
Jony obojnacze aminokwasów są rodzajem wewnętrznych soli. Dzięki amfoterycznemu charakterowi, mogą reagować jak kwasy lub zasady zależnie od okoliczności. I tak w wodnym kwasowym roztworze zachowuje się on jak zasada, przyłączając proton i stając się kationem, gdzie anion karboksylanowy –COOH- działa jako centrum zasadowe i przyłącza proton. Natomiast w wodnym zasadowym roztworze zachowuje się jak kwas, tracąc proton i stając się anionem, gdzie kation amoniowy –NH3+ działa jako centrum kwasowe i oddaje proton.
20 aminokwasów pospolicie występujących w białkach należą do α-aminokwasów, co oznacza że grupa aminowa jest podstawnikiem na atomie węgla bezpośrednio sąsiadującym z grupą karboksylową. Dodatkowo większość aminokwasów jest pierwszorzędowa z jednym wyjątkiem, jakim jest prolina, która jest aminokwasem 2 rzędowym , ponieważ zarówno atom azotu jak i atom węgla wchodzą w budowę pierścienia pirolidynowego.
Wszystkie aminokwasy za wyjątkiem glicyny mogą tworzyć dwie formy enancjomeryczne, podsiadając centrum stereogeniczne na α atomie węgla.
Aminokwasy można przedstawić za pomocą projekcji Fishera, umieszczając grupę karboksylową u góry (podobnie jak u cukrów), natomiast grupę aminową po lewej stronie. Z powodu podobieństwa do L-cukrów, takie aminokwasy nazywa się L-aminokwasami.
Aminokwasy możemy podzielić na dwa sposoby:
Aminokwasy endogenne, które są syntetyzowane w organizmie człowieka. I tak z tych związków możemy wyróżnić aminokwasy kwasowe, do których należą kwas glutaminowy oraz kwas asparaginowy.
Aminokwasy egzogenne, które są dostarczane z zewnątrz do organizmu np. z pokarmem. Natomiast z tej grupy aminokwasów można sprecyzować aminokwasy zasadowe jakimi są: lizyna, arginina, histydyna oraz tryptofan.
Reakcja Hella-Volharda-Zelinskiego jest jedną z najstarszych metod otrzymywania aminokwasów. W metodzie tej najpierw następuje bromowanie kwasu karboksylowego w pozycji α-atomu węgla za pomocą Br2 i PBr3. W drugim etapie zachodzi substytucja nukleofilowa za pomocą nadmiaru amoniaku i powstaje α-aminokwas. Aby uzyskać większą wydajność tej reakcji stosuje, się ftalimidek Gabriela (ftalimidek potasu) zamiast amoniaku.
Drugą metodą otrzymywania aminokwasów jest synteza amidomalonianowa, która rozpoczyna się od przekształcenia acetamidomalonianu dietylu w anion enolanowy. Po czym przeprowadzona jest substytucja nukleofilowa za pomocą pierwszorzędowego halogenku alkilowego, a później hydroliza do kwasu i ostatecznie dekarboksylacja prowadząca do powstania aminokwasu.
Inna metodą syntezy aminokwasów jest aminowanie redukcyjne polegające na działaniu amoniakiem na α-oksokwas, w obecności borowodorku sodu jako reduktora. Metoda ta stanowi analogię do naturalnej drogi biosyntezy niektórych aminokwasów, w których rolę reduktora pełni dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (czyli NADH).
Wszystkie podane syntezy aminokwasów prowadzą do utworzenia mieszanin racemicznych, w których znajduje się równa ilość enancjomerów S i R. Aby otrzymać czysty aminokwas, należy daną mieszaninę rozdzielić. Można tego dokonać najpierw przeprowadzając aminokwas do formy amidowej i następnie poddać go reakcji z pojedynczym enancjomerem chiralnej aminy, w wyniku czego powstają dwie diastereoizomeryczne sole lub użyć biologicznej metody rozszczepienia przy użyciu enzymu, który katalizuje hydrolizę amidu i oddziela pożądany aminokwas od nieprzereagowanego amidu.
Innym i bardziej wydajniejszym sposobem rozdziału mieszaniny racemicznej aminokwasów jest enancjoselektywna metoda Knowlesa. William Standish Knowless urodzony w 1917 roku w Taunton, był Amerykańskim chemikiem. W 1942 roku otrzymał doktorat w Columbia University. Po studiach zaczął pracę w Monsanto Company w St. Louis w stanie Missouri i pracował tam do emerytury w 1986 roku. W 2001 roku został uhonorowany Nagrodą Nobla za badania nad syntezą enancjoselektywna, gdzie jako pierwszy zastosował związek optycznie czynny w roli katalizatora.
Główną zasadą syntezy enancjoselektywnej jest znalezienie chiralnego katalizatora, który tworzy w czasie reakcji asymetryczne otoczenie wokół cząsteczki substratu. Dzięki temu substrat może łatwiej ulegać reakcji z jednej ze stron, co prowadzi do tworzenia tylko jednego enancjomeru aminokwasu w produkcie. Przed paru laty William Knowles odkrył, że można otrzymać aminokwas: S-fenyloalaninę przez uwodornienie Z-enamidokwasu na chiralnym katalizatorze.
(kompleks rodu(I) z cyklooktadienem(COD) i chiralnym difosfanem)
Peptydy i białka są polimerami aminokwasów, w których poszczególne aminokwasy, zwane resztami aminokwasowymi, połączone są wiązaniami peptydowymi (inaczej zwanymi wiązaniami amidowymi). Łańcuchy zbudowane z mniej niż 50 aminokwasów nazywamy peptydami, a termin białko używany jest do łańcuchów dłuższych. Szkielet białkowy zapisuje się zgodnie z konwencją, tak aby N-koniec był zawsze po lewej stronie, natomiast C-koniec po prawej.
Atomy azotu grup amidowych nie są zasadowe, ponieważ ich wolne pary elektronowe są zdelokalizowane w wyniku nakładania się orbitali z grupą karbonylową, co nadaje częściowy charakter wiązania podwójnego między atomem węgla i azotu.
Drugim rodzajem wiązania kowalencyjnego występującego w peptydach jest mostek disulfidowy, tworzący się pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi i powodujący tworzenie pętli. Przy tworzeniu aminokwasów, niepożądaną grupę cysteinową można zablokować za pomocą kwasu jodooctowego.
Określenie struktury peptydu wymaga ustalenia z ilu i z jakich aminokwasów jest zbudowany, oraz w jakiej kolejności one występują. Można to ustalić dzięki analizatorowi aminokwasów opracowanym w 1950 roku na Uniwersytecie Rockefellera w Nowym Jorku przez Williama Steina i Stanforda Moore’a. William Howard Stein urodzony w 1911 roku w Nowym Jorku, był Amerykańskim biochemikiem. W 1938 roku otrzymał doktorat w Columbia College. Po studiach zaczął pracę w Rockefeller Institute, gdzie pracował do końca życia. W 1972 roku został uhonorowany Nagrodą Nobla wraz z Stanfordem Moore’em za opracowanie metod analizy aminokwasów i określenie struktury rybonukleazy.
Przed analizą peptyd zostaje rozbity na składowe aminokwasy przez hydrolizę wszystkich wiązań amidowych. Otrzymaną mieszaninę umieszcza się na szczycie kolumny chromatograficznej wypełnionej specjalnym adsorbentem i przepuszcza się przez nią szereg buforów. Aminokwasy migrują w dół kolumny z różną prędkością, zależnie od struktury i punktu izoelektrycznego, a następnie są rozdzielane. Po wyjściu z kolumny mieszane są z ninhydryną, dając fioletowe zabarwienie. Intensywność zabarwienia jest rejestrowana przez spektrometr i otrzymuje się wykres zależności absorbancji od czasu elucji, który ma stałą i powtarzalną wartość dla poszczególnych aminokwasów.
Ostatnim etapem analizy peptydów jest sekwencjonowanie, czyli stwierdzenie w jakiej kolejności wykryte aminokwasy są ze sobą połączone. Przyczynił się do tego Pehr Victor Edman urodzony w 1916 roku w Sztokholmie, który był Szwedzkim biochemikiem. W 1935 roku otrzymał doktorat z medycyny w Karolinska Institute. Po studiach odbył staż w Rockefeller Institute, a następnie został profesorem na Uniwersytecie w Lund w Szwecji. W 1957 roku przeniósł się do St. Vincent’s School of Medical Research w Australii, gdzie opracował metodę sekwencjonowanie peptydów. Jego doniosłe osiągnięcia nigdy nie zostały nagrodzone stosownie do ich znaczenia.
Sekwencjonowanie rozpoczyna traktowanie peptydu izotiocyjanianem fenylu (PITC), który przyłącza się w addycji nukleofilowej do N-końca grupy aminowej peptydu. Cyklizacja katalizowana kwasem solnym daje następnie pośredni związek tetraedryczny, który wydziela peptyd o skróconym łańcuchu i anilinotiazolinon (ATZ). Następnie związek ten przegrupowuje się w wodnym kwasowym środowisku, co prowadzi do ostatecznego produktu fenylohydantoiny (PTH), którą identyfikuje się chromatograficznie, a skrócony peptyd poddaje się następnemu cyklowi degradacji Edmana. Degradacja Edmana staje się niepraktyczna przy dużych peptydach i białkach, gdzie nagromadzenie niepożądanych produktów ubocznych ogranicza stosowanie metody do około 50 cykli.
Częściową hydrolizę można przeprowadzić na drodze chemicznej lub enzymatycznej. Hydroliza enzymatyczna katalizuje rozpad peptydu przy grupie karboksylowej zasadowych aminokwasów argininy i lizyny za pomocą trypsyny, a aminokwasów podstawionych grupą arylową (np. fenyloalaniny) za pomocą chymotrypsyny. Degradację Edmana można wykorzystać również do oznaczania reszty C-końcowej za pomocą enzymu karboksylopeptydazy, do rozerwania wiązania amidowego.
Synteza aminokwasów jest utrudniona przez konieczność ich ułożenia w ściśle określonym porządku. Problem ten rozwiązano opracowując odpowiednie metody blokowania grup –COOH i –NH2. Przebiega ona w kilku etapach. W pierwszym etapie należy zablokować grupę aminową, oraz karboksylową za pomocą odpowiednich odczynników. Następnie należy przyłączyć aminokwasy za pomocą dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) i ostatecznie usunąć grupy blokujące.
Grupy karboksylowe można blokować za pomocą standardowych metod tworzenia estrów, a następnie usunąć przez hydrolizę lub w przypadku estrów benzylowych przez katalityczne uwodornienie słabego wiązania węgiel-tlen z użyciem palladu jako katalizatora.
Grupy aminowe często są ochraniane w formie pochodnych tert-butoksykarbonyloamidowych (BOC), które powstają w reakcji substytucji nukleofilowej z diwęglanem di-tert-butylowym. Natomiast są one usuwane za pomocą kwasu trifluorooctowego.
Wiązania peptydowe są tworzone są podczas działania na blokowany kwas i aminę dicykloheksylokarbodiimidem (DCC). I tak, w pierwszym etapie kwas karboksylowy przyłącza się do karbodiimidu, tworząc reaktywny czynnik arylujący. Następny etap polega na nukleofilowym ataku aminy na dany czynnik, dając tetraedryczny produkt pośredni. Ostatecznie produkt pośredni odłącza dicykloheksylomocznik i pożądany amid.
Inną metodę syntezy peptydów opracował Robert Bruce Merrifield urodzony w 1921 roku w Fort Worth, był Amerykańskim biochemikiem. W 1949 roku otrzymał doktorat w University of California. Po studiach rozpoczął pracę w Rockefeller Institute, gdzie pracował przez pozostałe lata. W 1984 roku otrzymał nagrodę nobla z chemii za opracowanie metod automatycznej syntezy peptydów.
Technika Merrifielda, zwana inaczej techniką stałego podłoża prowadzona jest na perełkach z polistyrenu blokujących grupę estrową, w których mniej więcej co setny pierścień fenylowy polistyrenu wbudowana jest grupa chlorometylowa. Na początku zablokowany aminokwas jest łączony wiązaniem estrowym z polimerem polistyrenowym w reakcji substytucji nukleofilowej. Następnie aminokwas zostaje przemyty z nadmiaru odczynnika i zostaje usunięta grupa blokująca za pomocą kwasu trifluorooctowego. Trzeci etap polega na połączeniu dwóch aminokwasów za pomocą DCC, a nadmiar reagentów jest usunięty przez przemywanie. Cykl jest powtarzany do przyłączenia wszystkich reszt aminokwasowych, a ostatecznie za pomocą bezwodnego fluorowodoru usuwa się końcową grupę blokującą BOC i rozszczepia wiązanie estrowe z polimerem.
Białka są to duże biocząsteczki zbudowane z reszt α-aminokwasowych połączonych ze sobą wiązaniami amidowymi (inaczej peptydowymi). Dzieli się je na dwie grupy, w zależności od składu, gdzie wyróżniamy białka proste, które w wyniku hydrolizy dają tylko aminokwasy, oraz białka złożone, które dają również inne związki takie jak na przykład węglowodany, tłuszcze czy kwasy nukleinowe. Inny podział ze względu na trójwymiarową postać wyróżnia białka fibrylarne, składające się z łańcuchów polipeptydowych ułożonych obok siebie w długie włókna. Są one odporne i nierozpuszczalne w wodzie, a w naturze używane do budowy tkanek konstrukcyjnych. Innym rodzajem są białka globularne, zwykle zwinięte w zwarty kulisty kształt. Są dobrze rozpuszczalne w wodzie i swobodnie przemieszczają się w obrębie komórki.
…
…
Zsyntetyzowany w komórce łańcuch białkowy przypomina unoszącą się swobodnie w roztworze "nitkę", która może przyjąć dowolny kształt, ale ulega procesowi tzw. zwijania białka tworząc mniej lub bardziej sztywną strukturę przestrzenną, zwaną strukturą lub konformacją białka. Białka są tak duże, że określenie struktura przyjmuje szersze znaczenie i przez to można rozróżnić cztery różne poziomy struktury. ...
…
… Ponieważ enzymy są zwykle dość elastyczne strukturalnie, ich centrum aktywne podlega ciągłym rearanżacjom przestrzennym podczas oddziaływania z substratami. W rezultacie, substrat nie tyle wiąże się do niezmiennego strukturalnie miejsca aktywnego, ale grupy boczne aminokwasów je tworzące podlegają zmianom przestrzennym, ściśle dopasowując swe pozycje do wiązanego substratu, co dopiero umożliwia przeprowadzenie katalizy. Centrum aktywne kontynuuje rearanżację, aż osiągnięte zostanie końcowe stadium dopasowania z substratem.
…
… Denaturacji towarzyszą zmiany właściwości zarówno fizycznych jak i chemicznych białka. Drastycznie spada rozpuszczalność, czego przykładem jest ścinanie się białka jaja podczas gotowania, kiedy to albuminy rozwijają się i koagulują w nierozpuszczalną białą masę.
…
…
…
…
…
…
DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ