Laboratorium z Mikrobiologii Przemysłowej

Temat: „Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych metodą chemiczną”

1. Cel ćwiczenia:

Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych przy użyciu detergentu, Tween 80.

Liza detergentem - Tween 80

Metoda ta jest często używana do dezintegracji komórek utrzymywanych w hodowli tkankowej. Jest bardzo zachowawcza jeśli chodzi o własności izolowanych białek jeśli tylko stężenie detergentu potrzebnego do lizy komórek jest niewysokie. Najczęściej używane detergenty to: Triton X-100, NP-40, dodecylan sodowy, siarczan sarkozylu, deoksycholan sodowy i inne. W naszym doświadczeniu jako detergentu używamy Tween 80, jego zadaniem jest zniszczenie ściany komórkowej. W ćwiczeniu korzystamy również z buforu, który niweluje ładunek w ścianie komórkowej.

2. Materiały:

drożdże piekarskie, bufor tris 50 mM pH 7.0, Tween 80, woda destylowana

3. Wykonanie:

a) metoda chemiczna

10g drożdży piekarskich rozpuściłyśmy w 50 ml wody destylowanej i wstawiłyśmy do wirówki o temperaturze 4 ^oC na 5min. Następnie otrzymany osad rozpuściłyśmy w 50 ml buforu i dodałyśmy 0,5ml odczynnika dezintegrującego, Tween 80 i inkubowałyśmy na wytrząsarce, w temperaturze 30°C przez 20min. Na koniec odwirowałyśmy po 5ml naszego ekstraktu, w dwóch probówkach i z otrzymanego roztworu wyznaczałyśmy stężenie białka metoda Bradford'a.

4. Metoda Bradforda

a) cel ćwiczenia: oznaczenie ilości białka

b) materiały: roztwór albuminy, odczynnik Bradforda, roztwór białek (wyizolowanych po metodzie chemicznej)

c) sporządzenie krzywej standardowej:

• Posiadając wzorcowy roztwór albuminy o stężeniu 1mg/ml, sporządziłyśmy 1ml roztworu albuminy o stężeniu 0,2 mg/ml w probówce eppendorfa. (0,2ml albuminy i 0,8ml wody destylowanej).

• Następnie w kolejnych probówkach eppendorfa umieściłyśmy 1ml odczynnika Bradforda i kolejno roztwory albuminy: 10, 20, 30, 40, 50 μl.

• Po upływie 5 min zmierzyłyśmy absorbancję przygotowanych roztworów przy długości fali 595 nm w spektrofotometrze wobec próby kontrolnej (odczynnik Bradforda).

d) oznaczanie ilości białka metodą Bradforda:

• W probówkach eppendorfa umieściłyśmy po 1ml odczynnika Bradford'a a następnie dodawałyśmy kolejno odpowiednie ilości badanego roztworu: 20, 30, 40 ,50 μl i mieszałyśmy. Na koniec wykonałyśmy pomiar absorbancji przy 595nm wobec próby kontrolnej.

5. Obliczenia i wyniki:

1. Krzywa standardowa.

• Obliczanie masy białka albuminy w poszczególnych próbkach. Wyniki dla pozostałych objętości zamieszczone są w tabeli 1.

V₁ = 10 µl = 0,010 ml

C_{0, albumina} = 0,2 mg/ml

m = C_{0, albumina}·v₁ = 0,2·0,010 = 0,002 mg = 2 µg

Tabela1

v albuminy [µl]	A595	m albuminy [µg]
10	0,079	2
20	0,121	4
30	0,231	6
40	0,327	8
50	0,417	10

• Wykres zależności absorbancji od masy albuminy w poszczególnych próbkach.

2. Oznaczanie ilości białka metodą Bradforda.

• Obliczanie masy białka w poszczególnych próbkach na podstawie zmierzonej absorbancji oraz wzoru funkcji krzywej standardowej. Wyniki dla pozostałych objętości zamieszczone są w tabeli 2.

Wzór krzywej standardowej: y = a*x

A = 0,0441*m - 0,0296

A₁ = 0,468

m₁ = (A+0,0296)/0,0441 = (0,468+0,0296)/0,0441 = 11,283µg

• Obliczanie stężenia białka na podstawie krzywej standardowej. Wyniki dla pozostałych mas i objętości zamieszczone są w tabeli 2.

m₁ = 11,283µg

v₁ = 0,020 ml

C_1e = m₁/v₁ = 11,283/0,020 = 564,15 µg/ml

• Obliczanie średniego stężenia białka w próbkach.

C_śr = ΣC/4 = 491,265 µg/ml

Tabela 2

v białka [µl]	A595	m ekstraktu [µg]	Ce [µg/ml]	C śr [µg/ml]	m w 10 ml [µg]
20	0,468	11,28	564,15	491,27	4912,7
30	0,623	14,8	493,27
40	0,799	18,79	469,73
50	0,936	21,9	437,92

6. Wnioski:

Stężenie białka w ekstrakcie komórkowym wynosi: 491,27 µg/ml. Masa białka w całej próbce mającej objętość 50 ml wynosi: 24,56 mg

Zależność absorbancji od masy wyizolowanego białka jest przedłużeniem zależności absorbancji od masy albuminy (krzywa standardowa), ponieważ roztwór wyizolowanego białka nie został rozcieńczony przed pomiarem absorbancji, jednakże przedstawiony wykres pokazuje ,że wyizolowane białko pokrywa się z naszą krzywą .

---