W4

STREPTOMYCYNY

Rodzina antybiotyków:

• Streptomycyna

• Mannozylostreptomycyna

• Dihydrostreptomycyna

• Mannozylodihydrostreptomycyna

• N-demetylostreptomycyna

• Hydroksystreptomycyna

PROCES WYTWARZANIA STREPTOMYCYNY:

1967 r. -Singh et all opis procesu laboratoryjnego

• Streptomyces griseus DTH₂ - liofilizowane spory zmieszane z ziemią zostają umieszczone na płytkach Petriego lub butelkach Rouxa z agarem sojowym, inkubacja 2-3 tyg, w temp. 27°C

• inokulum

• I etap: kultury wegetatywne; 0,5-2 l kolby Erlenmayera, sojowe podłoże A

• II etap: fermentator 5 l, sojowe podłoże B

• proces właściwy- fermentator produkcyjny, podłoże B, pH 7-6,5-7,5, mieszanie, napowietrzanie (trofofaza, idiofaza)

• oczyszczanie:

• zawiesina pohodowlana

• filtracja lub odwirowanie - przesącz (50 m³, 5,5 g/cm)

• + 50 m³ H₂O

• chromatografia jonowymienna

• wymywanie związku EDTA, woda nasycona CO₂, 2,5 M H₂SO₄

• wodny roztwór siarczanu streptomycyny (2700 l, 90 g/cm)

• dekoloryzacja na węglu aktywnym

• zagęszczanie pod próżnią

• suszenie

• 275 kg siarczanu streptomycyny 98% czystości

POSZUKIWANIE NOWYCH AMINOGLIKOZYDÓW

• skrining + inżynieria genetyczna

• mutageneza

• modyfikacje chemiczne lub enzymatyczne

• synteza chemiczna

CEFALOSPORYNY

Antybiotyki β-laktamowe produkowane przez Cephalosporium (grzyb). Mechanizm działania analogiczny do penicylin (hamuje syntezę białka...). Poszczególne generacje cefalosporyn różnią się przenikalnością do OUN i odpornością w stosunku do β-laktamaz.

Proces wytwarzania FBC (Feed Batch Culture). W lecznictwie stosuje się ponad 50 cefalosporyn.

W4

CEFAMYCYNY

Cefamycyna C- Nocardia lactamdurans, Streptomyces clavuligerus; trwałe

Gram (-)- oporne na β-laktamazy

Cefoksytyna- zmodyfikowana cefamycyna (grupa tienacetylowa).

LINKOZAMIDY

Linkomycyna- Streptomyces lincolnensis, metylotioaminocukier + aminokwas, Gram (+) (Staphylococcus sp., Diplococcus sp. ) oraz beztlenowce; dobra przenikalność do tkanek i kości; działanie- hamowanie biosyntezy białka 50S.

ANTYBIOTYKI PEPTYDOWE

Blastycydyna S- Pyricularia oryzae, Streptomyces sp., rolnictwo

Bleomycyna, Bestatyna - terapia p/nowotworowa

• Bleomycyna- hamowanie syntezy białek kwasów nukleinowych

• Bestatyna- hamuje aminopeptydazy

ZWIĄZKI P/NOWOTWOROWE

Rośliny, mikroorganizmy, ssacze kultury tkankowe. Trudności przy procesie produkcji: toksyczność, wydzielanie, oczyszczanie; detoksyfikacja ścieków.

W4

1. Poszukiwanie i izolacja odpowiednich produktów- izolacja produktu.

2. Preskrining - linie P388 mysiej leukemii.

3. Testy in vitro sposób podania leku.

4. I faza badań klinicznych.

5. II faza badań klinicznych.

6. III i IV faza badań klinicznych.

Bezpieczeństwo przy produkcji leków cytotoksycznych- bariery biologiczne, filtry HEPA, czujniki, blokady, detoksyfikacja ścieków.

ANTRACYKLINY

Należą do najszerzej używanych związków p/nowotworowych.

Budowa: chromofor antrachinowy podstawiony jednym lub więcej cukrem.

Dannorubicyna (Daunomycyna)- Streptomyces coeruleorubidus

Doksorubicyna (Adriamycyna)- mutant; Streptomyces peucetius; szerokie spektrum działania

PROCES PRODUKCJI DAUNOMYCYNY

Streptomyces peucetius, glikozyd, 60-70 μg/ml daunomycyny, 5-15 μg/ml adriamycyny.

METODA I:

Skosy agarowe (10 dni, 26-27°C), kultury w kolbach (2 dni, mieszanie, napowietrzanie), 800 l fermentator (28°C, 67 h).

METODA II:

Kultury w 4 l kolbach (zamrożone mycelia, 28°C, 2,5 dnia), 100 l fermentator (30°C, 24h), 1000 l fermentator (12 dni), 10000 l fermentator (7-10 dni).

PROCES PRODUKCJI ADRIAMYCYNY

Agarowe skosy (26-27°C, 10 dni), homogenizacja zaszczepu i zawieszenie w wodzie, kultury w kolbach (48 h), wytrząsanie (28°C), 800 l fermentator (27°C, 67-145°C).

ANTYBIOTYKI NUKLEOZYDOWE

Najsilniejsze czynniki cytotoksyczne, hamują biosyntezę kwasów nukleinowych i białek, wykazują aktywność antybiotyczną, antywirusową, immunosupresyjną.

Produkcja: Streptomyces sp., Nocardia sp.

Enzymy cytotoksyczne:

L-asparaginaza- hamuje asparaginozależną biosyntezę białka i ewentualnie kwasów nukleinowych; limfocytowa leukemia u dzieci.

W4

CO JESZCZE BIOTECHNOLOGIA DAJE MEDYCYNIE?

PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE

• diagnostyka, terapia chorób zakaźnych

• badanie właściwości antygenowych białek

• charakterystyka wirusów

• transplantacja organów

KONIUGATY PRZECIWCIAŁO-LEK

• indukowane wirusem komórki nowotworowe (limfoma myszy)

• produkcja przeciwciał kozich (infekcja co 5 dni)

• surowica- wysalanie 33% siarczanem amonu

• frakcje immunoglobulin- odwirowanie, rozpuszczenie w buforze

• trawienie pepsyną, 0,1 M octan sodu, pH 4,5, 16 h, 37°C

• fragmenty (Fab)₂

• lek w postaci utlenionej, kowalencyjne wiązanie typu zasady Schiffa

• redukcja i stabilizacja wiązania p/ciało-lek (HBr)

• gotowy koniugat (2-10 moli leku / 1 mol p/ciała)

SIDEROFORY

Makroelementy - fosfor, wapń, magnez, potas, sód, żelazo.

Fe³⁺ - warunki tlenowe Fe²⁺ - warunki beztlenowe

Rola żelaza w organizmach żywych (mikroorganizmy)

Skład komórki	niedobór żelaza powoduje zahamowanie wzrostu, zmniejszenie syntezy kwasów nukleinowych, hamowanie sporulacji, zmiany morfologii komórki
Metabolizm	procesy wymagające żelaza: CKT, transport elektronów, fosforylacja oksydacyjna, wiązanie azotu, biosynteza aminokwasów aromatycznych, fotosynteza
Produkty metabolizmu	biosynteza porfiryn, toksyn, witamin, antybiotyków, pigmentów, kwasów nukleinowych (regulowane żelazem)
Białka i enzymy wymagające żelaza	peroksydazy, dysmutazy nadtlenkowe, nitrogenazy, hydrogenazy syntaza glutaminy, cytochromy, ferrodoksyna, flawoproteiny

Mikroorganizmy wykształciły specjalne mechanizmy umożliwiające pobieranie żelaza ze środowiska.

zewnątrz błona komórkowa wewnątrz

enterobaktyna  ←  enterobaktyna (synteza de novo)

↓Fe³⁺ ↓Fe²⁺

ferri-enterobaktyna  → produkty hydrolizy

rozpuszczanie  transport  asymilacja

W4

CECHY SIDEROFORÓW

• substancje niskocząsteczkowe (względna masa cząsteczkowa mniejsza 1500)

• rozpuszczalne w wodzie

• wiążą żelazo z wysoką swoistością i powinowactwem (stała stabilność 10³⁰)

• związki fenolowe lub hydroksomaty

enterobaktyna- bakteria jelitowe

ferichromy- grzyby

ferrioksoamina- promieniowce

egzochelina- bakteria śluzowe

Drobnoustroje wytwarzają siderofory zazwyczaj wtedy, gdy nikła dostępność żelaza ogranicza ich wzrost. Siderofory mogą posiadać aktywność antybiotyczną: sideromycyna, albomycyna, ferrimycyna. Produkcja przemysłowa sideroforów jest trudna. Siderofor produkowany na skalę przemysłową: deksterioksamina (Desferal) produkowany przez Streptomyces pilosus.

WYKORZYSTANIE SIDEROFORÓW

• zatrucia żelazem- terapia chelatowa (cechy dobrego chelatora: łatwość produkcji, efektywność, specyficzność, toksyczność, dostęp do puli);

• hemochromatoza

• usuwanie toksycznych metali z organizmu

• zastosowanie pozamedyczne: rolnictwo (Pseudomonas putida- pseudobaktyna; Rhizobium)

FERMENTACJA STEROLI

Steran- 4-pierścieniowy system cyklopentanoperhydrofenantrenu.

Hormony sterydowe - ważna funkcja metaboliczna.

Przemysł - leki.

wypchnięte przez analogi półsyntetyczne

W4

Analogi półsyntetyczne:

• diosgenina (Discorea mexicana, Discorea composita)

• stygmasterol

• β- i γ- sitosterole (nasiona soi, bawełny i trzciny cukrowej)

W4

MIKROBIOLOGICZNA KONWERSJA STEROLI OBEJMUJE:

• dehydrogenację

• epoksydację

• estryfikację

• izomeryzacje

• hydrolizę acetali

• hydrolizę estrów

• hydrolizę epoksydów

• hydroksylację

• utlenianie alkoholi i ketonów

• redukcja ketonów i podwójnych wiązań

REAKCJE O ZNACZENIU PRZEMYSŁOWYM

1. Hydroksylowanie w pozycji 11α i 11β, np. hydroksylowanie progesteronu w pozycji 11α

produkty uboczne: 6-α-, 11-β-dihydroksyprogesteron

Rhizopus arrhizus, Rhizopus nigricans, Aspergillus ochraceus

W4

Currularia lunata, Cunninghamella blakestleeana

MECHANIZM REAKCJI HYDROKSYLOWANIA- polega na wprowadzeniu jednego atomu tlenu cząsteczkowego do substratu przy udziale specyficznych oksygenaz i redukcji drugiego do H₂O.

steroid steroid OH

enzym-FeO²⁺ enzym - Fe²⁺

NADP⁺ NADPH + H⁺

H₂O O₂

2. Dehydrogenacja w pozycji Δ¹

Arthrobacter simplex, Bacillus sphaericus, Nocardia restricus, Septomyxa affinis, Fusarium solani

W4

3. hydroksylowanie w pozycji 16-α.

Streptomyces argenteolus

4. Modyfikacje łańcuchów bocznych.

Nocardia sp., Streptomyces sp., Arthrobacter sp., Mycobacterium sp.

Grupa ketonowa (C-17) oraz grupa karboksylowa (C-20).

PROCES FERMENTACJI STEROIDÓW

Produkty o znaczeniu komercyjnym:

• kortyzon

• hydrokortyzon

• testosteron

• testolakton

• flokortolon

• preolnizon

• preolnizolon

BIOTECHNOLOGIA SZTUCZNYCH KOMÓREK

Błony komórki sztucznej:

• półprzepuszczalna

• grubość 0,002 μm - 1,8 nm

• uzyskuje się w procesie emulsyfikacji a następnie polimeryzacji międzyfazowej (silastik, octan celulozy, nylon polietyloaminowy, materiały biodegradowalne).

Zamykanie systemów enzymatycznych wymagających systemu regeneracji kofaktora:

• heksokinaza i kinaza pirogronianowa (regeneracja ATP)

• glukoza → glukozo-6P

• fosfoenolopirogronian → pirogronian

• dehydrogenaza alkoholowa i dehydrogenaza jabłczanowa (NAD⁺ → NADH)

• ureaza, dehydrogenaza glutaminianowa, dehydrogenaza glukozo-6P (mocznik → amoniak → α-ketoglutaran)

W4

Sztuczne komórki zawierające komórki biologiczne i inny materiał biologiczny:

• sztuczne organy

• powierzchnia wymiany 33 ml śr 0,1 mm → 2 m ²

• przepuszczalność 0,002 μm → 20 μm

• detoksyfikatory krwi

• sztuczna wątroba

• sztuczna nerka

• substytuty krwi

NOWE TRENDY BIOTECHNOLOGII DLA MEDYCYNY

• 1990 r.- Humane Genome Project USA

• Functional Genomics, FunctIonal Proteomics

• technologia rekombinacji DNA

• inżynieria białka - wykorzystanie organizmów transgenicznych

• systemy ekspresji:

• prokariotyczny system ekspresji Escherichia coli

• eukariotyczny system ekspresji (Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris)

• systemy ekspresji oparte na hodowlach komórek ssaków (chomik, małpa)

• hodowle owadzie (system bakulowirusa, Drosphilla melanogaster)

• ekspresja heterologicznych białek w gruczołach mlecznych ssaków (myszy, króliki, owce, kozy, krowy)

• systemy roślinne

• szczepionki (rekombinowane szczepionki antygenowe, hybrydowe szczepionki wirusowe i bakteryjne, antyidiotopowe, hybrydowe, białkowe, antygenowe syntetyczne peptydy)

• terapia genowa

• strategia antysensu i rybozymowa

• metody diagnostyczne

10

---