Sprawozdanie z ćwiczeń 8-9

Grupa: Aut2

Sekcja:

Gatlik Aleksandra

Jarosz Aldona

Bensz Wojciech

Temat: Fermentacja alkoholowa. Porównanie efektywności różnych szczepów drożdży. Reakcje Identyfikacyjne zanieczyszczeń alkoholu.

Daty wykonania ćwiczeń:

I 17.05.2010

II 24.05.2010

Cel ćwiczenia: Porównanie efektywności fermentacji alkoholowej przeprowadzanej przez różne szczepy drożdży w założonych hodowlach fermentacyjnych. Identyfikacja zanieczyszczeń obecnych w podłożu po tygodniowej inkubacji i w próbkach napojów alkoholowych.

1.Wstęp teoretyczny:

Wykorzystanie drożdży do produkcji alkoholu było pierwszym historycznie nieświadomym zastosowaniem żywych organizmów przez człowieka w przetwarzaniu żywności. Drożdże to grzyby jednokomórkowe z rodzajów Saccharomyces, Schizosaccharomycies i Candida należących do workowców. W zależności od gatunku wykazują zróżnicowane cykle życiowe z przemianą pokoleń di- i haploidalnych. U wielu gatunków i szczepów drożdży występują także formy poliploidalne. Drożdże oddychają tlenowo, są również zdolne do życia w warunkach beztlenowych, przeprowadzają wówczas fermentację alkoholową. Wydajność wytwarzania alkoholu etylowego i zdolność do wzrostu w obecności jego dużych stężeń są cechami charakterystycznymi różnych szczepów i gatunków drożdży. Fermentacja alkoholowa przebiega przez glikolizę z wytworzeniem pirogronianu, który w kolejnym etapie jest przekształcany przez dekarboksylazę pirogronianową w aldehyd octowy z wytworzeniem dwutlenku węgla. Końcowym etapem fermentacji jest redukcja aldehydu octowego do etanolu przez dehydrogenazę alkoholową. Wydzielanie dwutlenku węgla jest wykorzystywane w produkcji ciasta drożdżowego, gdzie wydzielany przez drożdże dwutlenek węgla powoduje wzrost pulchności ciasta. Dostępność tlenu hamuje proces fermentacji, zjawisko to zostało nazwane efektem Pasteura. Wydajność wytwarzania alkoholu przez drożdże zależy m.in. od efektywności wydzielania go na zewnątrz komórek warunkującego zachowanie jego odpowiednio niskich stężeń wewnątrz komórek. Do efektywnego wydzielania etanolu drożdże potrzebują m.in. steroli i kwasu oleinowego. Do ich syntezy konieczne są pewne śladowe ilości rozpuszczonego tlenu (odwrotny efekt Pasteura), alternatywę stanowi wzbogacenie podłoża w warunkach ściśle beztlenowych. Również wysokie ciśnienie osmotyczne, które może być spowodowane także przez zbyt wysokie stężenie cukru w pożywce, wpływa niekorzystnie na wydzielanie etanolu a więc pośrednio na jego produkcję.

Drożdże w sprzyjających warunkach gromadzą w swoich komórkach glikogen, który może być obserwowany w postaci ziarnistości pod mikroskopem z zastosowaniem barwienia płynem Lugola. Do obserwacji komórek drożdży można zastosować też błękit metylenowy, który wnika do martwych komórek przez nieciągłości błony komórkowej. Żywe komórki w preparacie wybarwionym błękitem metylenowym nie wykazują zabarwienia, ale występują wokół nich niebieski otoczki barwnika zaadsorbowanego (?) na powierzchni błony/ściany (?) komórkowej. Wydaje mi się, że zabarwiła się ściana komórkowa, zaś błona komórkowa żywych komórek nie przepuściła barwnika . Ale nie znalazłam na necie info, które potwierdziłoby moją teorię

3.Materiały i metody:

Materiały:

I część:

• sok winogronowy (jasny) - Hortex

• sacharoza

• drożdże winiarskie do wina białego

• drożdże piekarnicze

• fosforan amonu

• kolby z rurkami fermentacyjnymi

• parafina

• szkiełka podstawowe i nakrywkowe

• błękit metylenowy

• płyn Lugola

• waga laboratoryjna

II część:

• roztwór jodu w jodku potasu;

• KOH, roztwór 1 n;

• kwas octowy;

• 1% nitroprusydek sodowy;

• 10% NaOH;

• 1% FeCl₃;

• 0,1% rezorcyna;

• stężony kwas siarkowy;

• probówki, statywy, pipety szklane.

Założenie hodowli fermentacyjnych:

Podłoża:

• Kolba o pojemności 250 ml z jasnym sokiem winogronowym (150cm³) i szczypą fosforanu amonu

• Kolba o pojemności 250 ml z 20% roztworem sacharozy (150cm³) i szczypą fosforanu amonu

Posiew i przygotowanie hodowli:

• dodano 2ml drożdży winiarskich do wina białego do kolby z sokiem winogronowym

• dodano drożdży piekarniczych do kolby z roztworem sacharozy

• zamknięto kolby przy pomocy korka z waty oraz folii aluminiowej w celu odcięcia dostępu powietrza (dla zapewnienia warunków beztlenowych)

• umieszczono rurki fermentacyjne z wodą (odprowadzanie CO₂)

Inkubacja:

• zważono i opisano układy

• kolby pozostawiono do inkubacji w temperaturze ok. 20-30°C na okres

7 dni

Obserwacje mikroskopowe:

• Naniesiono kroplę zawiesiny drożdży i kroplę roztworu błękitu metylenowego na szkiełko podstawowe w celu zbadania żywotności drożdży, przykryto szkiełkiem nakrywkowym

• Naniesiono kroplę zawiesiny drożdży i kroplę płynu Lugola na szkiełko podstawowe w celu zbadania obecności glikogenu w komórkach drożdży, przykryto szkiełkiem nakrywkowym

• Obserwowano pod mikroskopem, pod powiększeniem 40x

Reakcje identyfikacyjne zanieczyszczeń w alkoholu:

1. Test na wykrycie obecności etanolu, wykorzystujący reakcję Liebena:

• dodano do 2.5 ml przesączu (brakowało mi tego słowa )5ml roztworu KOH i 5ml roztworu jodu

• dokładnie wymieszano i ogrzano do temperatury 50°C w łaźni wodnej:

• Test na wykrycie obecności acetonu, wykorzystujący reakcję Liebena:

• dodano do 2.5 ml przesączu 5 ml roztworu KOH i 5 ml roztworu jodu

• wymieszano i odczekano 10 minut

Test na wykrycie obecności kwasu octowego, wykorzystujący reakcję Legala:

• do 3ml przesączu dodano 1 ml nitroprusydku sodowego a następnie kilka kropel roztworu NaOH

• Test na wykrycie obecności kwasów lotnych (mrówkowego i octowego):

• do 2ml przesączu dodano kilka kropel roztworu 1% FeCl₃

• Test na wykrycie obecności aldehydu mrówkowego, octowego i benzoesowego:

• do 2ml przesączu dodano 2ml roztworu rezorcyny

• ostrożnie nawarstwiono (po ściankach probówki) ok. 2ml stężonego kwasu siarkowego

4.Wyniki:

Obserwacje mikroskopowe:


Po wybarwieniu błękitem metylenowym.

Po wybarwieniu płynem Lugola







	Masa przed fermentacją [g]	Masa po fermentacji [g]	Ubytek masy [g]	Ubytek masy [%]
Sok z drożdżami winiarskimi	256,1	253,6	2,5	0,97
Sok z drożdżami piekarskimi	223,6	217,7	5,9	2,6
Roztwór sacharozy z drożdżami winiarskimi	190,5	190,1	0,4	0,21
Roztwór sacharozy z drożdżami piekarskimi	232,5	222,2	10,3	4,43

To co napisałam bardziej podchodzi pod obserwacje. Wyniki zestawiła Ola w tabelce. Jeśli uważacie, że jest to niepotrzebne to można to usunąć

• Reakcja Liebena na występowanie etanolu:

Widoczne skupiska małych pływających kłaczków w obu probówkach.

• Reakcja Liebena na występowanie acetonu:

W probówce z sokiem i drożdżami winiarskimi zaobserwowano bladożółty osad.

W probówce z roztworem sacharozy i drożdżami piekarskimi nie zaobserwowano zmian.

• Reakcja Legala na występowanie kwasu octowego:

Powstało brunatno-zielone zabarwienie w obu probówkach.

• Reakcja na występowanie kwasów lotnych:

W obu probówkach nie zaobserwowano zmian.

• Reakcja na występowanie aldehydu mrówkowego, octowego i benzoesowego:

W probówce z sokiem i drożdżami winiarskimi zaobserwowano rozwarstwienie się cieczy. Poniżej białego pierścienia pojawiła się czerwono-fioletowa warstwa i żółta warstwa.

W probówce z roztworem sacharozy i drożdżami piekarskimi zaobserwowano barwę fioletowo- czerwoną.

Reakcja na występowanie:	Sok z drożdżami winiarskimi	20 % r-ór sacharozy
Etanolu	+	+
Acetonu	+	-
Kwasu octowego	-	-
Kwasów lotnych	-	-
Aldehydu mrówkowego, octowego i benzoesowego	+ - -	+ - +

Obliczenia

Całe umieszczamy co po kolei liczono? Jak tak to trzeba zmienić na formę bezosobową.

1)Ponieważ sok którego użyto był substancją płynną, zawierającą cukier gronowy, wodę oraz wszelkie dodatki, założono że był to 20 % roztwór o znanej gęstości. Czyli:

Jeśli mieliśmy 150 cm3 soku to w nim znajdowało się 30 cm3 cukru gronowego.

Wzór sumaryczny cukru gronowego(czyli glukozy) - C₆H₁₂O₆

masa: 180,16 g, gęstość 1,54 g/cm3 (z wiki)

z równania ro=m/v wynika => m=ro*v

masa = 1,54 g/cm3 * 30cm3 = 46,6 g

więc w kolbie mieliśmy 30/180,16 = 0,25 mola glukozy.

Główny wzór fermentacji przedstawia się następująco:

C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2

1)Jeśli więc nam ubyło w przypadku soku winogronowego 2,5 g (co2)

180,16 g	92.14 g	88 g
C6H12O6 ->	2 C2H5OH +	2 CO2
x= 5,11 g	y=2,61 g	2,5 g

180,16 g - 88 g CO₂ 180,16 g - 92,14 alkoholu

x - 2,5 g x=2,5*180,16 / 88 5,11 g - y y=5,11*92,14/180,16

Obliczone równanie stechiometryczne dla soku winogronowego z użyciem drożdży: do fermentacji alkoholowej:

0,02 C6H12O6 -> 0,0141 C2H5OH + 0,0142 CO2

Więc jeśli w naszej kolbie mieliśmy 46,6 g glukozy to ze 100 % wydajnością powinniśmy otrzymać 23,88 g etanolu

Wydajność = 2,61 g /23,88 g *100 % = 10,929 %

1. W przypadku sacharozy

Sacharoza pod wpływem wody hydrolizuje do glukozy i fruktozy.

342,3 g + 18 g	180,16 g	180,16 g
C12H22O11 + H2O - >	C6H12O6	C6H1206
20 g	x=10,42	x=10,42




342,3 g - 180,16 g

20 - x g x = 10,52 g

Więc jeśli dodaliśmy 20 g sacharozy, to powinniśmy teoretycznie otrzymać 10,42 g glukozy i 10,42 fruktozy. W takim przypadku drożdże miały 2 substraty do przeprowadzenia fermentacji: glukozę i fruktozę.

360,32g	184,28 g	176 g
2 C6H12O6 ->	4 C2H5OH +	4 CO2
x=12,07 g	y=6,17 g	5,9 g

360,32 g - 184,28 g CO2

x g - 5,9 g CO2 x= 5,9 * 360,32 /176 g x = 12,07 g

360,32g - 184,28 g alkoholu

12,07 - y g alkoholu y=12,07 * 184,28 / 360,32g y= 6,17 g

Wydajność: 2 cząsteczki cukru glukozy i fruktozy (20,84 g) przy 100 % wydajności dały by 10,65 g etanolu.

Wydajność = 6,17/10,65 *100% = 57,93 %

Obliczone równanie stechiometryczne dla roztworu z 20 % sacharozą z użyciem drożdży piekarniczych:

Wojtek sprawdź te obliczenia, bo coś mi nie pasuje w tej sacharozie, i w ogóle te równanie jakieś dziwne mi wyszło.

0,335 C6H12O6 -> 0,0334 C2H5OH + 0,335 CO2

5. Wnioski:

2. To są moje przemyślenia

3. Zastosowanie drożdży piekarniczych do roztworu sacharozy przyniosło lepsze efekty, niż w przypadku zastosowania wyselekcjonowanych bakterii przeznaczonych do produkcji białego wina do soku z białych winogron firmy Hortex. Po przeprowadzeniu wszystkich reakcji na występowanie danych produktów ubocznych oraz głównego produktu etanolu, można stwierdzić, iż roztwór sacharozy przebiegł z lepszą wydajnością niż w przypadku soku z winogron. Wszędzie tam, gdzie zastosowano drożdże piekarnicze, był większy ubytek masy niż w przypadku zastosowania drożdży do produkcji białego wina. Powodem mogło być dodanie dużych odłamków drożdży, w których znajdowała się większa ich ilość niż w przypadku dodania drugiego gatunku drożdży, a dokładniej 1,5 ml. Drożdże te znajdowały się przez pewien czas w pożywce, w zamkniętym opakowaniu, związku z tym liczebność żywych organizmów z biegiem czasu mogła maleć. Natomiast drożdże piekarnicze były w fazie biostatycznym. Ich populacja nie malała w opakowaniu. Podczas przeprowadzenia barwienia za pomocą błękitu metylenowego drożdży do fermentacji alkoholowej zauważono, że tylko 50 % organizmów wykazuje funkcje życiowe, a ...(nie mam pojęcia) % zachowało substancje zapasowe - glikogen, co umożliwiło bakteriom na przeżycie w ciężkich warunkach.

Prawdopodobnie sok z winogron prócz cukru gronowego zawierał dodatkowo substancję konserwujące, jak i wzbogacające smak co miało negatywny wpływ na przeprowadzenie fermentacji. Skutkiem tego powstały fuzle, m. in. aceton i aldehyd mrówkowy i benzoesowy.

Po tygodniowej inkubacji zarówno kolba z drożdżami winiarskimi jak i z piekarskimi posiadała charakterystyczny zapach dla etanolu. Na tej podstawie stwierdzono, że w reakcji Liebena otrzymano właściwy produkt czyli etanol. Niepożądane produkty (np. aldehyd octowy czy kwas mlekowy) również dają dodatnią reakcję.

Wykryte niepożądane związki aldehydu mrówkowego, acetonu oraz aldehydu benzoesowego często pojawiają się przy fermentacji alkoholowej. Dla otrzymania czystego alkoholu (nadającego się do spożycia) konieczne jest przeprowadzenie procesu destylacji.

Literatura:

• Chmiel A.: „Biotechnologia”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998

• Schlegel G.H.: „Mikrobiologia ogólna”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003

---