5192605661

[7] BADANIE ODDZIAŁYWANIA BIAŁKO — LIGAND *59

frakcje z obszaru plateau (3 wykorzystać do wyznaczenia kolejnego punktu izotermy wiązania, odpowiadającego wyższemu stężeniu ligandu.

Technika wysycania równowagowego (50—52) oparta jest na bezpośrednim optycznym skanowaniu małej chromatograficznej kolumny, wysyconej roztworem zawierającym białko i ligand. Stosunek mierzonych wartości absorbancji (po uwzględnieniu linii podstawowej, otrzymanej po zrównoważeniu żelu buforem) w obszarze zawierającym żel oraz w obszarze ponad żelem jest równy tzw. przekrojowi podziału £, reprezentującemu objętość rozdziału składnika na jednostkę długości kolumny. Dla składnika j:

Ęj = a + p<Tj

gdzie: a oznacza przekrój objętości pustej, (3 — przekrój objętości wewnętrznej, a o — współczynnik podziału. W wyniku pomiarów otrzymuje się wartości £, a i (3, znormalizowane do jednostkowej powierzchni przekroju kolumny. Równowagowe stężenie ligandu [L] oblicza się z równania (51):

_rT1 , Ql([L]) _rT , Ę_L-ę_b

[L]H--= [Lo] —--=—    (równanie 6)

t_g —c_b    tg^-

w którym [L„] oznacza całkowite stężenie ligandu, a Q_L ([L]) — stężenie ligandu związanego przez żel. Przekroje podziału oblicza się nasycając kolumnę buforem zawierającym substancję nie ulegającą wiązaniu przez żel, np. glicyloglicynę (£_g = a + (3), buforem zawierającym samo białko (£_b, zwykle równe a) lub buforem zawierającym białko w stężeniu [B₀]

i ligand w stężeniu [L₀] (1*_L). Izotermę wiązania ligandu przez żel Q_L ([L]) należy wyznaczyć wcześniej, nasycając kolumnę buforem zawierającym sam ligand, w stężeniu [L] i korzystając z równania:

Ql = [L](t_L-c_g)    (równanie 7)

Znając [L] Łatwo obliczyć stopień wiązania r jako [L₀]—[L]/[B₀].

Technika charakteryzuje się ogromną precyzją, jeszcze większą niż w przypadku analizy czołowej. Wynika to z faktu, że każdy z ok. 100— 200 punktów otrzymywanych w wyniku skanowania traktować można jako niezależny eksperyment, co pozwala na krytyczne opracowanie statystyczne mierzonych wielkości. Duża szybkość ustalania się równowagi tworzenia kompleksu nie jest warunkiem koniecznym. Ze względu na spektrofotometryczny charakter pomiarów zakres zastosowań ogranicza się do układów, w których widma mieszanin ligand wolny-ligand związany charakteryzują się występowaniem punktu izozbestycznego poza zakresem absorpcji białka. Inną wadą jest dość duże zużycie białka. Metoda wysycania równowagowego była następnie modyfikowana (53). Podobne zasady wykorzystane zostały w tzw. szerokostrefowej modyfikacji