5192605679

[13] BADANIE ODDZIAŁYWANIA BIAŁKO — LIGAND 45

Zaletą tej techniki jest prostota oraz możliwość badania słabych oddziaływań, takich jak w przypadku układu owoalbumina-jon HP0₄^2-, z k rzędu 100 M^-1. Poważną wadą jest niemożność obliczenia ilości miejsc wiążących n, bez uprzedniej znajomości parametru 5. Dla oszacowania jego wartości należy odwołać się do teorii ruchliwości elektroforetycznej H e n r y’e g o (100) lub Abrahamsona (101), których omówienie znaleźć można w każdym szerszym opracowaniu poświęconym elektroforezie. Ogólnym ograniczeniem technik elektroforezy ruchomej granicy jest konieczność zużycia znacznych ilości białka.

Wykazano, że precyzyjne pomiary ruchliwości elektroforetycznej możliwe są również przy zastosowaniu strefowej elektroforezy bibułowej (102, 103). Technikę tę wykorzystano w badaniach oddziaływania jonów cynku i kadmu z albuminą surowicy (104), wzorując się pod względem sposobu interpretacji na wcześniejszym wariancie elektroforezy czołowej (105). Fundamentalnym założeniem była proporcjonalność ruchliwości elektroforetycznej i ładunku białka:

AZ_b = Auf

Współczynnik f obliczano z równania Henry’ego lub korzystano z opublikowanych korelacji empirycznych (106). Biorąc pod uwagę kompetycję pomiędzy jonami metalu i jonami wodorowymi i zakładając prosty model

wiązania, otrzymano parametry oddziaływania z zależności-j od

Ostatnio na przykładzie układu owoalbumina-fosforan zaprezentowano sposób wykorzystania standardowej elektroforezy w żelu poliakrylo-amidowym do wyznaczania parametrów oddziaływania białko-jon (107). Przy odpowiednim doborze warunków eksperymentalnych, ruchliwości białka u_R i u_B w równaniu 16 można zastąpić przez względne współczynniki przesunięcia R_f. Metoda jest niewątpliwie najłatwiejsza do wykonania z wszystkich dotąd omówionych. Pozwala na badanie bardzo słabych oddziaływań, ze stałymi k rzędu 100 M^-1 i zużywa minimalne ilości białka. Do badania można używać próbek nieoczyszczonych, zawierających wiele składników białkowych! Można przypuszczać, że w najbliższym czasie technika ta zyska powszechne uznanie. Jej ograniczeniem, wspólnym jednak dla wszystkich metod elektroforetycznych, jest aprioryczne założenie najprostszego modelu oddziaływania białko-ligand.

VI. Elektroforeza powinowactwa

Termin „elektroforeza powinowactwa” rezerwuje się najczęściej dla technik elektroforetycznych, prowadzonych w żelach zawierających unieruchomione ligandy. Ogólne zasady i zakres zastosowań tej metody omawiano w kilku artykułach przeglądowych (108—111). W chwili obecnej,