5192605667

[9] BADANIE ODDZIAŁYWANIA BIAŁKO — LIGAND 4H

B + L_a ^ BL_ab

+	+
L„	Lb
Kb U	Kba U K

BL_b + L_a ^ BL_bL_a

gdzie L oznacza ligand związany z podłożem chromatograficznym, L —

ligand wolny, K — stałe asocjacji kompleksów rozpuszczalnych, K — stałe asocjacji dla kompleksów unieruchomionych. Objętość wypływu białka V oblicza się z równania:

(Vq - V_P) (K_a [L_a] + K_bK_ba [L„] [L_a]}

1 + K_b [L_b]

(równanie 8)

gdzie V_p — oznacza pustą objętość kolumny, V₀ — objętość wypływu w razie braku oddziaływania białka z ligandami.

W opisanych układach ligand związany z żelem oraz ligand wolny to całkowicie różne substancje. Większość zastosowań praktycznych oparto jednak na zjawisku kompetycji między ligandem rozpuszczalnym a unieruchomionym ligandem o podobnej naturze chemicznej. W najprostszym przypadku białka mono walencyjnego rozważa się zatem dwie równowagi:

K

B + L ^ BL

K

B + L ^ BL

W obecności ligandu rozpuszczalnego w stężeniu [L] białko jest wymywane z kolumny w objętości V, określonej równaniem (69):

1    _    (1+K[B]>    K[L]

V-V₀ f^-1(V₀-V_p) K. [L]    f^_1(V₀-V_P)K[L] (^{rownanie 9})

gdzie f oznacza frakcję fazy nieruchomej dostępną dla białka a znaczenie pozostałych symboli podano w opisie równania 8. Parametry wiązania odczytuje się z wykresu -—— ([L]). Objętość wypływu białka V można

v — v₀

wyznaczyć metodą ciągłego wymywania (69—72), w której roztwory o stałych stężeniach białka wprowadza się w sposób ciągły na kolumnę do chwili otrzymania dobrze wykształconych frontów elucji, wykorzystywanych do obliczania stałych wiązania. Opisano wariant metodyczny, w którym oznacza się nie objętość elucji lecz ilość związanego białka (73). Wadą wszystkich metod wymywania ciągłego jest stosunkowo duże zużycie białka.

Inny sposób wyznaczania objętości V polega na zrównoważeniu ko-