8857685806

Badanie oddziaływań BK - DROŻDŻOWY S' HYBRYDOWY 15

Test dwuhybrydowy

Jeśli badane białka, czyli AtSWBB oraz FCA, oddziałują ze sobą, kolonie drożdży staną się niebieskie. Brak niebieskiego zabarwienia będzie świadczył o braku oddziaływań pomiędzy tymi białkami w zastosowanym układzie. Przy przeprowadzaniu testu istotne jest wykonanie szeregu kontroli. Należy wykonać analogiczny test dla drożdży transformowanych pojedynczymi plazmidami (kontrola negatywna), po to, żeby sprawdzić, czy pojedyncze białka nie są zdolne do aktywacji transkrypcji. Może się bowiem zdarzyć, że białko, sfuzjowane z domeną aktywującą transkrypcję, będzie miało zdolność do wiązania się z DNA. W takiej sytuacji układ złożony z pojedynczego białka będzie sam aktywował transkrypcję.

Dodatkową, wspólną kontrolą dla wszystkich analizowanych układów sądrożdże stransformowane plazmidem pLCl (kontrola pozytywna), dlaktórych również wykonuje się podobny test. Na plazmidzie tym kodowane są obie domeny niezbędne do aktywacji transkrypcji, a zatem domena wiążącą się z DNA (BD) oraz domena aktywująca transkrypcję (AD). Zabarwienie się kolonii pozytywnych kontroli na kolor niebieski będzie świadczyć o poprawnym wykonaniu testu. Kolonie kontroli negatywnych powinny pozostać białe.

Schemat doświadczenia

1.    Transformacja drożdży konstruktami:

FCA/pGAD424 (kontrola negatywna) AtSWI3B/pGBT9 (kontrola negatywna)

- FCA/pGAD424 i AtSWI3B/pGBT9 pLCl (kontrola pozytywna)

2.    Hodowla drożdży

3.    Test dwuhybrydowy

Tydzień 1

Dzień 1. Transformacja drożdży

Jest to szybka, jednoetapowa metoda uzyskania kompetentnych komórek drożdży i następnie ich transformacji.

Uważa się, że obecność ditiotreitolu (DTT) w roztworze A używanym do transformacji drożdży zmienia strukturę kompleksów mannoproteidowych w ścianie komórkowej drożdży. W efekcie zwiększa się liczba porów lub/oraz plastyczność ścian komórkowych, co sprzyja przedostawaniu się wysokocząsteczkowych kwasów nukleinowych do wnętrza komórek. Jednoniciowy nośnikowy DNA dodatkowo ułatwia wprowadzanie cząsteczek plazmidu do komórek drożdży. Drożdże po transformacji wysiewa się na pożywkę minimalną (WO) z dodatkiem jedynie tych aminokwasów, których dane transformanty nie są w stanie same syntetyzować. Na plazmidzie pGBT9 znajduje się jeden z genów szlaku biosyntezy tryptofanu, natomiast na plazmidzie pGAD424 oraz pLCl

-    leucyny. Dlatego też drożdże po transformacji plazmidem / konstruktem AtSWI3B/pGBT9 wysiewa się na pożywkę minimalną WO bez tryptofanu, drożdże po transformacji plazmidem / konstruktem FCA/pGAD424 lub pLCl na pożywkę WO bez leucyny, a drożdże po transformacji oboma plazmidami / konstruktami, tj. FCA/pGAD424 oraz AtSWI3B/pGBT9, na WO bez leucyny i tryptofanu. Postępowanie takie umożliwia wyselekcjonowanie transformantów (użyty szczep drożdży nie jest w stanie syntetyzować tryptofanu ani leucyny).

Wydajność tej metody wynosi około 10⁴ transformantów/pg plazmidowego DNA.

Materiały:

-    Roztwór A: 40% glikol polietylenowy 4000 (PEG 4000), 0,2 M octan litu,

100 mM ditiotreitol (DTT)

-    Jednoniciowy DNA nośnikowy (10 mg/ml)

-    YPG - pożywka pełna do hodowli drożdży (bacto-pepton 1%, ekstrakt drożdżowy 1%, agar 2%)

-    WO-pożywka używana do selekcji transformantów (yeast nitrogen base) 0,67%, glukoza 2%, agar 2%, mieszanina aminokwasów i nukleotydów z wyjątkiem wymagania pokarmowego używanego do selekcji, np. tryptofanu: WO-trp, leucyny: WO-leu)

-    Szczep drożdży Y190

-    Preparaty plazmidowego DNA: AtSWI3B/ pGBT9 oraz FCA/pGAD424, pLCl

-    Probówki typu Eppendorf

-    Głaszczka

-    sterylne wykałaczki

-    Palnik, zapalarka

-    lód

Hodowle stałe (na szalkach) drożdży, preparaty DNA oraz szalki z pożywką uczestnicy zajęć otrzymują od prowadzących.