Analiza mikrobiologiczna wody

W wodzie oprócz typowej flory wodnej występują też bakterie alloktoniczne: glebowe oraz ściekowe

Bakterie wodne występują tu psychrofile (optimum 20°C). tlenowce, względne tlenowce oraz bakterie reprezentujące wszystkie typy pokarmowe, chociaż głównie występuje prototrofy. Bakterie wodne uczestnicza w oczyszczaniu wody ze związków organicznych

Bakterie glebowe - są spłukiwane z gleby do wód wraz z opadami

Bakterie ściekowe - oprócz bakterii heterotroficznych żyjących na szczątkach organicznych występują tu bakterie flory jelitowej oraz bakterie chorobotwórcze

Drobnoustroje pochodzące ze ścieków:

• Wirusy:

• Enterowirusy, np. wirus nagminnego zapalenia wątroby, wirus polio, wirus Coxsackie, wirus ECHO

• Bakterie

• Shigella sp. - wywołuje czerwonkę

• Salmonella sp - biegunki, dur brzuszny

• Vibrio cholereae - cholera

• E. coli - zapalnie żołądka, biegunki

• Campylobacter jejuni

• Legionella pneumophila - infekcje płuc

• Yersinia enterocalitica

• Pierwotniaki

Jeśli wodzie jest mało bakterii to i tak może dojść do zakażenia, ponieważ woda spożywana jest w wielkich ilościach

Analiza mikrobiologiczna wody nie polega na izolowaniu i określaniu patogenów, ponieważ występują one w bardzo małych ilościach przez co możemy nawet nie wykryć ich obecności.

Dlatego właśnie o obecności mikroorganizmów patogennych wnioskuje się pośrednio, badając obecność bakterii wskaźnikowych, które stale żyją jako saprofity w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt. Jeśli stwierdzimy dużą liczbę bakterii wskaźnikowych to może to świadczyć o obecności bakterii patogennych

Warunki jakie muszą spełniać bakterie by mogły być wskaźnikami sanitarnymi:

• Muszą być stale obecne w przewodzie pokarmowym

• Duża ich liczba w kale (przewodzie pokarmowym) w jelicie grubym

• Długość ich życia w środowisku zewnętrznym musi być dłuższa niż długość życia gatunków patogennych

• Nie mogą wytwarzać form przetrwanych - ponieważ muszą to być świeże zanieczyszczenia a nie sprzed 10 lat :P

• Muszą być łatwe do zidentyfikowania

Jakie bakterie od razu odpadają:

• Bakterie bezwzględnie beztlenowe oraz mikroaerofile - ponieważ nie przetrwają w środowisku zewnętrznym

• Bakterie przetrwalnikowe, np. Clostridium

Wszystkie warunki spełnia za to Escherichia coli

Escherichia coli wchodzi w skład tzw. grupy coli

Najpierw oznacza się bakterie z grupy coli

Cechy bakterii z grupy coli:

• Laktozo-dodatnie -> fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu (wytwarzają β-galaktozydazę)

• Oksydazo-ujemne -> nie posiadają oksydazy

• Gram ujemne pałeczki

• Nie wytwarzają przetrwalników

• Są zdolne do wzrostu w warunkach tlenowych i względnie beztlenowych

• Zdolne do wzrostu w obecności soli żółci i innych czynników powierzchniowo czynnych hamujących wzrost

• Zdolne do fermentacji laktozy z wytworzeniem kwasu, aldehydu i gazu

• Inkubacja 48 h w temp 36+-2°C

• Tworzą na podłożu Endo charakterystyczne bordowe kolonie z metalicznym połyskiem

• Dodatkowo Escherichia coli wytwarza:

• Indol z tryptofanu

• Enzym β-glukuronidazę

• Poza tym ma zdolność do dekarboksylacji kwasu L-glutaminowego

Wszystkie te cechy wykorzystywane są w prostych, barwnych reakcjach

Bakterie z grupy coli dzieli się na dwa typy:

• Typ fekalny - bakterie fermentujące laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w 37 i 44°C (np. Escherichia coli)

• Typ ziemny - bakterie niezdolne do fermentacji laktozy w 44°C (ale fermentują w temp. 37°C): są to bakterie ziemne (np. Citrobacter sp., Enterobacter sp.)

Obecność w wodzie bakterii z grupy coli świadczy o skażeniu badanej wody ściekami bądź glebą.

Miano coli - najmniejsza objętość badanej wody w której znajduje się co najmniej jedna bakteria z grupy coli (czyli najmniejsza objętość wody dla której wychodzi pozytywny wynik testu)

Indeks coli - liczba bakterii grupy coli w 100ml badanej wody

Przebieg analizy wody:

1. Badanie ogólnej liczby bakterii na AO, metodą płytek lanych po 72h inkubacji:

1. w temp 22+-2°C -> wyrosną bakterie psychrofilne (wodne i glebowe)

2. w temp 36°C -> wyrosną bakterie mezofilne (ściekowe oraz niektóre bakterie wodne i glebowe)

2. Oznaczanie bakterii grupy coli na podłożu Eijkmana - badanie zdolności bakterii do fermentacji laktozy. Jeśli bakterie fermentują laktozę to fioletowa barwa podłoża Eijkmana ulegnie zmianie na żółtą (w wyniku zakwaszenia) oraz w rurce Durhama będzie znajdował się gaz.

Probówki inkubujemy w temp:

1. 37°C -> wyrosną bakterie typu ziemnego i fekalnego

2. 44°C -> wyrosną bakterie tylko typu feralnego

Dzięki temu będziemy wiedzieć z jakim typem skażenia mamy do czynienia: ziemnym czy fekalnym

3. Wykrywanie Escherichia coli oraz bakterii grupy coli

1. metodą filtrów membranowych (co najmniej 100ml wody) - metoda stosowana przy przewidywanym małym zagęszczeniu bakterii.

Po przepuszczeniu wody filtr inkubuje się na podłożu wybiórczo-różnicującym, a następnie liczy się wyrosłe kolonie

2. posiew powierzchniowy na odpowiednim podłożu wybiórczo-różnicującym. Następnie liczymy powstałe kolonie

Stosuje się 2 rodzaje podłóż do 2 testów:

1. I test - stosujemy podłoże selekcyjno-różnicujące TTC do badania zdolności do fermentacji laktozy -> tym testem wykrywamy bakterie z grupy coli

Podłoże TTC:

• Laktoza

• Pepton

• Ekstrakt drożdżowy i mięsny heptodecylosiarczan sodu (hamuje wzrost bakterii gram+)

• TTC - barwnik; podłoże wokół bakterii Lac^- jest czerwone, natomiast wokół bakterii Lac⁺ jest bezbarwne, dlatego dodajemy jeszcze jeden barwnik-

• Błękit bromotymolowy - nadaje podłożu wokół bakterii Lac^- kolor żółty

Na podłoże TTC kładziemy filtr przez który uprzednio przepuściliśmy badaną próbkę wody - chcemy sprawdzić obecność bakterii z grupy coli

Następnie wszystkie charakterystyczne kolonie (Lac⁺) poddajemy drugiemu testowi - przesiewamy je na 2 podłoża

1. II test - analiza bakterii Lac⁺ pod kątem wytwarzania oksydazy oraz indolu - tym testem wykrywamy E.coli

• Test na obecność oksydazy -> bakterie grupy coli nie posiadają oksydazy

Bakterie z poprzedniego testu wysiewamy na agar niewybiórczy (cytochrom C utlenia pewien związek i przenosi elektrony na oksydaze cytochromową, a ta na tlen - pozytywna reakcja jest wtedy kiedy pojawi się niebieskofioletowe zabarwienie po dodaniu hodowli na bibułę nasączona tym związkiem)

• Test na wytwarzanie indolu z tryptofanu -> Escherichia coli tworzy z tryptofanu indol.

Bakterie wysiewamy na bulion tryptofanowy (bulion odżywczy + tryptofan). Escherichia coli tworzy z tryptofanu indol.

Indol wykrywamy za pomocą odczynnika Kovacsa - wiśniowo czerwona obrączka na górze hodowli świadczy o obecności indolu a więc i Escherichia coli

• Dodatkowy test pozwalające wykryć Escherichia coli

Test na obecność β-glukuronidazy (umożliwia ona hydrolizę glukuronidów)

Escherichia coli posiada β-glukuronidazę, który przekształca bezbarwny β,D-glukuronid w niebieski związek.

Kolonie E. coli na podłożu zawierającym β,D-glukuronid mają niebieski kolor

• Jeśli chcemy jednocześnie określić liczbę bakterii z grupy coli oraz komórki Escherichia coli to przygotowujemy stałe agar odżywczy ze związkiem MUG-gal

• Bakterie grupy coli rozkładają tą substancję β-galaktozydazą -> powstaje produkt zdolny do fluorescencji w świetle UV (kolonie świecą na ten kolor)

• β,D-glukuronidaza - powstają kolonie zabarwione na ciemnoniebieski kolor

Zminiaturyzowana metoda wykrywania i obliczania liczby E.coli w wodzie i ściekach

• Przygotowuje się pojemnik z studzienkami mikropłytkimi do których następnie wlewa się odpowiednie podłoże

• Podłoże - pepton, tritonX (hamuje bakterie gram+), MUG-gal, woda

• Odpowiednio rozcieńcza się wodę. Pobiera się 200μl określonego rozcieńczenia za pomocą pipety ….. i wprowadza do studzienek mikropłytkich z odpowiednim podłożem

• Pojemnik zalepia się taśmą a następnie pozostawia do inkubacji w 44°C

• Następnie płytkę umieszcza się w komorze do obserwacji w świetle UV - studzienki w których w świetle UV widać niebieskie zabarwienie zawierają Escherichia coli

• Określa się najbardziej prawdopodobną liczbę E.coli

Wynik odczytuje się ze stosunku pozytywnych wyników w różnych rozcieńczeniach, np.

Badanie wody do kąpieli przy użyciu 64 studzienek

- w rozcieńczeniu 1:2 świeciły 32 studzienki

- w rozcieńczeniu 1:20 świeciło 5 studzienek

Stosunek 32/5 - odczytujemy z tablic wynik

Dla 32/5 najbardziej prawdopodobna liczba komórek wynosi 756 w 100 ml

Odczytane wartości należy pomnożyć przez współczynnik….

U nas współczynnik wynosi 10 (chyba podzieliła rozcieńczenai 20/2=10 :P)

Więc w 200μl znajduje się 7560 komórek Escherichia coli

Wyniki:

1. Badanie wody wodociągowej

1. Określanie liczbę bakterii psychro-(22°C) i mezofilnych (37°C) w wodzie wodociągowej

Na AO wysiewamy po 1 ml nierozcieńczonej wody wodociągowej metodą płytek lanych, a następnie inkubujemy płytki w temp 22 i 37°C w dwóch powtórzeniach

Na żadnej płytce nic nie wyrosło!!

2. Oznaczanie bakterii z grupy coli

Przygotowujemy 10 probówek z 10ml podłoża Eijkmana (z rurką Durhama) do którego dodajemy po 1 ml wody wodociągowej. Następnie 5 probówek inkubujemy w temp 37°C, a pozostałe 5 w temp. 44°C

W żadnej probówce nie zaobserwowaliśmy zmian

2. Badanie wody ze zbiornika

1. Określanie liczy bakterii psychrofilnych i mezofilnych

Przygotowujemy rozcieńczenia wody od 10^-1 do 10^-4. Każde rozcieńczenie wysiewamy na 4 płytki z AO. Z każdego rozcieńczenia 2 płytki inkubujemy w temp. 22°C, a dwie w 37°C

	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4
22°C	54 i 46 śr. 50 koloni	5 koloni	-	-
37°C	8 i 11 śr. 10 koloni	-	-	-

Liczba bakterii psychrofilnych=50*10¹*10=5*10³cfu/ml

Liczba bakterii mezofilnych=10*10¹*10=1*10³cfu/ml

2. Oznaczanie miana coli metodą fermentacyjną-probówkową

Do probówek zawierających podłoże Eijkmana i rurki Durhama dodajemy po 1 ml wody w rozcieńczeniach od 10⁰ do 10^-4 (w 2 powtórzeniach). Następnie jedną probówkę z danego rozcieńczenia inkubujemy w temp 37°C, a drugą w temp. 44°C

	10^0	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4
37°C	+	+	-	-	-
44°C	+	-	-	-	-

+ - zmiana zabarwienia na żółtą, gaz w rurce Durhama

- - brak zmiany zabarwienia na żółtą i gazu w rurce Durhama

[jest więcej bakterii typu ziemnego niż fekalnego]

Zakwaszenie podłoża (zmiana barwy podłoża z fioletowej na żółtą) i obecność gazu w rurce Durhama świadczą o występowaniu bakterii z grupy coli, przy czym jeśli takie zmiany podłoża obserwuje się w probówkach inkubowanych w 44°C - bakterii z grupy coli typu feralnego. Ostatnia probówka w szeregu z wynikiem pozytywnym stanowi podstawę do oznaczenia miana coli i miana coli typu feralnego. Brak gazu i zakwaszenia przyjmuje się jako wynik ujemny.

Obliczanie miana i indeksu coli:

Do oznaczania miana koli bierzemy największe rozcieńczenie, które dało wynik pozytywny:

-w temp 37°C - 10^-1 => 1ml*10^-1=0,1ml - miano coli

-w temp 44°C - 10⁰ => 1ml*10⁰=1ml

(mnożymy przez 1 ml ponieważ tyle wody dodaliśmy do podłoża Eijkmana)

Znając miano coli (objętość wody w której znajduje się co najmniej jedna żywa komórka z gr.coli) możemy prosto obliczyć indeks coli (liczba bakterii z gr. coli w 100ml)

1 - 0,1ml

x - 100ml

x=1000

1000/100ml - indeks coli

3. Oznaczanie bakterii z grupy coli w ściekach komunalnych metodą fermentacyjno-probówkową

Przygotowujemy rozcieńczenia ścieków w zakresie od 10^-1 do 10^-4. A następnie dodajemy je i inkubujemy tak samo jak w przypadku zbiornika wodnego

	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5
37°C	+	+	+	-	-
44°C	+	+	-	-	-

37°C:

miano coli=0,001ml

Indeks coli:

1 - 0,001ml

x - 100ml

x=10⁵

Mam nadzieję że notatki się komuś przydały ;)

Notatki by Placin

---