2012-01-16

1

Analiza mikrobiologiczna wody

Mikroflora wody

• Naturalne środowisko bytowania

drobnoustrojów;

• Liczebnośd drobnoustrojów w wodzie zależy od

ilości substancji organicznych;

• W wodach czystych (gdzie mało jest wyżej

wymienionych substancji) występują organizmy
oligotroficzne tj. zdolne do przyswajania
pokarmu, gdy znajduje się on w dużym
rozcieoczeniu;

• W zbiornikach wodnych dominują glony, sinice i

bakterie- organizmy psychrofilne;

• W wodzie możemy znaleźd przedstawicieli wszystkich grup

drobnoustrojów;

Dzieli się je na:
• Drobnoustroje autochtoniczne- czyli tubylcze, woda jest dla

nich naturalnym środowiskiem bytowania i rozwoju, zaliczamy
do nich: bakterie siarkowe np. z rodzaju Beggiatoa, bakterie
żelaziste np. z rodzaju Leptothrix, bakterie np. z rodzaju
Pseudomonas, grzyby np. Mucor sp. ;

• Drobnoustroje allochtoniczne- naniesione, zalicza się od nich:

drobnoustroje pochodzące z gleby i powietrza, z przewodu
pokarmowego ludzi i zwierząt, ze ścieków przemysłowych;

Mikroorganizmy które występują w wodzie ze względu

na ich znaczenie dla zdrowia i gospodarki człowieka
dzieli się na:

• Saprofityczne- nieszkodliwe dla ludzi i zwierząt

(autotrofy i heterotrofy);

• Patogenne- czyli chorobotwórcze;
• Szkodliwe w określonych gałęziach przemysłu;

Bakterie Patogenne

Dostają się do wody z przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt
i są przenoszone na następnego żywiciela- droga wodną
przenoszone są:

• Cholera wywołana przez Vibrio cholerae

(w wodach

powierzchniowych przeżywa kilka tygodni, w wodach wodociągowych kilka dni);

• Dur brzuszny (Salmonella typhi);

• Czerwonka (Shigella flexneri);

• Brucelloza (Brucella abortus);

• Gorączka błotna (Leptospira grippotyphosa);

• Żółtaczka zakaźna (Leptospira icterohaemorrhagiae);

• Wirusy np. Polio;

2012-01-16

2

• Wykrywanie zanieczyszczeo kałowych w wodzie

prowadzi się pośrednio przez badanie obecności
bakterii występujących w dużych ilościach w
przewodzie pokarmowym, łatwych w hodowli (bakterie
chorobotwórcze są dośd trudno do wyhodowania) i
przeważnie nieszkodliwych w stosunku do ludzi- są to
tzw. bakterie wskaźnikowe;

• Ich obecnośd w wodzie świadczy o jej zanieczyszczeniu

fekalnym, a zatem również o niebezpieczeostwie
zakażenia wody mikroorganizmami chorobotwórczymi;

Bakterie pełniące rolę wskaźników sanitarnych

powinny spełniad następujące warunki:

• muszą byd stale obecne w przewodzie pokarmowym człowieka,

co pozwala zawsze na wykrycie kałowego zanieczyszczenia wody;

• do grupy organizmów wskaźnikowych powinny należed także

formy nie przetrwalnikujące, co umożliwia wykrycie świeżego
fekalnego zanieczyszczenia wody ;

• identyfikacja musi byd możliwa przy użyciu łatwo dostępnych

metod;

• długośd życia bakterii wskaźnikowych w środowisku zewnętrznym

musi byd większa niż długośd życia gatunków chorobotwórczych;

• liczebnośd bakterii wskaźnikowych w jelicie człowieka i kale

powinna byd duża;

• nie powinny się rozmnażad w środowisku wodnym;

Wskaźniki fekalnego zanieczyszczenia wody

• Escherichia coli;
• Bakterie grupy coli;
• Paciorkowce kałowe (Enterokoki);
• Laseczki z rodzaju Clostridium ( Clostridium

perfringens), redukujące siarczyny;

• W niektórych przypadkach gronkowce

koagulazo-dodatnie;

• Pseudomonas aeruginosa;
• Legionella sp.;

Pałeczka okrężnicy (Escherichia coli)

• Fakultatywnie tlenowiec;
• Gram (-) pałeczka należąca do rodziny Enterobacteriaceae;
• Wchodzi w skład fizjologicznej flory bakteryjnej jelita grubego

człowieka oraz zwierząt stałocieplnych;

• W jelicie spełnia pożyteczną rolę, uczestnicząc w rozkładzie

pokarmu, a także przyczyniając się do produkcji witamin z
grupy B, C oraz K;

• E. coli spotyka się również w glebie i wodzie, gdzie trafiają z

wydzielinami i kałem. Bakterie te, zwykle nieszkodliwe w
jelicie, mogą jednak powodowad groźne schorzenia przewodu
pokarmowego, dróg moczowych, a ostatnio często dróg
oddechowych

Bakterie z grupy coli

• Bakterie grupy coli to przede wszystkim szczepy Escherichia

coli oraz drobnoustroje z rodzaju Enterobacter, Citrobacter i

Klebsiella. Wykrywane są one na podłożach z laktozą po

inkubacji w temperaturze 37

o

C.

• Bakterie grupy coli typu kałowego (termotolerancyjne) to

głównie szczepy Escherichia coli i tylko te nieliczne szczepy z

rodzajów Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella, które mają

zdolnośd fermentacji laktozy w temperaturze 44

o

C.

• Obecnośd w badanej próbce wody bakterii grupy coli lub

bakterii grupy coli typu kałowego świadczy o stosunkowo

świeżym zanieczyszczeniu wody kałem, ściekami, glebą lub

gnijącym materiałem roślinnym. W zasadzie dla większości

rodzajów wód zalecane jest oznaczanie liczby bakterii obu

grup coli.

Miano coli

• Służy do określenia występowania w wodzie

pałeczki okrężnicy;

• Jest to najmniejsza ilośd badanej próby (w ml lub

g) w których stwierdza się jeszcze obecnośd

pałeczek z grupy coli;

• Im woda jest silniej zanieczyszczona odchodami

tym miano coli jest niższe i tym jest większe

prawdopodobieostwo występowania w niej

drobnoustrojów z rodzaju Shigella (zaraza

czerwonki) i Salmonella (pałeczka duru

brzusznego);

• Dla wody wodociągowej normy polskie

przewidują miano coli powyżej 100;

2012-01-16

3

Paciorkowce kałowe

• Paciorkowce kałowe to grupa bakterii kulistych lub owalnych,

występujących w postaci komórek pojedynczych, dwoinek lub
krótkich łaocuszków. Obejmuje ona drobnoustroje z rodzajów:
Enterococcus i Streptococcus, m. in. Streptococcus faecalis, S.
faecium;

• Występują powszechnie w kale ludzi i zwierząt. Stwierdzenie

obecności paciorkowców kałowych w badanej próbie świadczy o jej
kontakcie z zanieczyszczeniami typu kałowego, podobnie jak
obecnośd bakterii grupy coli;

• Występowanie enterokoków w liczbie znacznie przewyższającej

liczbę bakterii grupy coli, sugerowad może zanieczyszczenie wody
kałem zwierzęcym lub ściekami, pochodzącymi z ferm hodowlanych;

• Paciorkowce fekalne na ogół charakteryzuje dłuższa przeżywalnośd w

wodzie oraz większa odpornośd na działanie chloru niż bakterie grupy
coli.

Laseczki z rodzaju Clostridium

• O starym, odległym w czasie zanieczyszczeniu kałowym może

świadczyd wykrycie w badanej próbce wody bakterii
redukujących siarczyny (głównie szczepy Clostridium
perfringens); ich przetrwalniki mogą zachowad żywotnośd przez
wiele lat w niesprzyjających warunkach;

• Przetrwalniki tych bakterii, a wraz z nimi również cysty

pasożytniczych pierwotniaków (Cryptosporidium parvum, Giardia
lamblia) powinny byd wyeliminowane właśnie w tych etapach
uzdatniania wody, gdyż są one bardzo oporne na działanie
środków dezynfekcyjnych;

• Wykrycie bakterii z rodzaju Clostridium jest technicznie znacznie

bardziej proste od poszukiwania pierwotniaków pasożytniczych i
daje dużą pewnośd, że woda uzdatniona jest wolna od
pierwotniaków i jaj robaków chorobotwórczych (helmintów).

Pseudomonas aeruginosa

• Obok wymienionych elementów analizy sanitarnej

proponuje się obecnie dodatkowo wykrywanie bakterii z

gatunku Pseudomonas aeruginosa w wodzie do picia i na

potrzeby gospodarcze a także w wodzie dla zakładów

kąpielowych oraz w wodach powierzchniowych;

• Przedstawicieli tego gatunku wyizolowano z kału ludzkiego

oraz w przypadkach zakażeo organizmu – z dróg

moczowych, ucha środkowego, ropiejących ran itp. Bakterie

te stanowią potencjalny czynnik chorobotwórczy dla ludzi i

zwierząt. Poza tym występują one powszechnie w wodach

powierzchniowych i glebie. Warto także podkreślid, że

mogą one bytowad w chlorowanej wodzie, gdyż odznaczają

się znaczną odpornością na zabiegi dezynfekcyjne.

Bakterie z rodzaju Legionella

• Bakterie z rodzaju Legionella są to Gram (-) pałeczki

posiadające polarnie umieszczone wici w liczbie od 1 do 3;

• Do wzrostu potrzebują żelaza i cysteiny. Ich naturalnym

rezerwuarem są wody śródlądowe i morskie. Licznie

występują również w glebie i gorących źródłach wody;

• Bakterie z rodzaju Legionella są wewnątrzkomórkowymi

pasożytami pierwotniaków. Mogą również powodowad

nietypowe zapalenie płuc u ludzi, jak i gorączkę Pontiac;

• Postaci płucnej legionellozy towarzyszy suchy kaszel,

zaburzenia w oddychaniu, temperatura powyżej 40°C,

zaburzenia świadomości. Śmiertelnośd wynosi 10-20%

zachorowao. Rezerwuarem tych bakterii są systemy ciepłej

wody i urządzenia wentylacyjne. Bakterie te mogą

kolonizowad wewnętrzne części rur z ciepłą wodą, zbiorniki

na ciepłą wodę, wieże chłodnicze; głowice natryskowe

pryszniców;

Ogólna liczebnośd bakterii

• W badaniach rutynowych określa się również

ogólną liczbę bakterii, jako liczbę jednostek
tworzących kolonie, w skrócie
j.t.k.(odpowiednik angielski: cfu - colony
forming units) obecnych w 1 ml wody, po
wykonaniu posiewu próbki na agar odżywczy i
inkubacji w temperaturach 22±2

o

C przez 72

godz. (psychrofile), oraz w 36±2

o

C przez 24

godz. (mezofile);

Kryteria jakości sanitarnej wody do picia w

Polsce

Lp.

Parametr

Najwyższa dopuszczalna wartość

Liczba

mikroorganizmów

[jtk]

Objętość próbki

[ml]

1

Escherichia coli

0

100

2

Enterokoki

0

100

Tabela 1. Podstawowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna
odpowiadad woda do picia

2012-01-16

4

Lp.

Parametr

Najwyższa dopuszczalna wartość parametru w próbce

wody

Liczba mikroorganizmów

[jtk]

Objętość próbki

[ml]

1

Bakterie grupy coli

0

100

4

Ogółna liczba mikroorganizmów w

36±2

o

C po 48 h

50

1

Ogółna liczba mikroorganizmów w

22±2

o

C po 72 h

100

1

5

Clostridium perfringens

0

100

Tabela 2. Dodatkowe

wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia

Częśd praktyczna

Materiał:
• Woda wodociągowa-

woda uzdatniona nie powinno byd E.coli;

• Woda powierzchniowa;
Podłoża:
• agar odżywczy;
• podłoże Eijkmana o składzie:pepton, laktoza, NaCl,

purpura bromokrezolowa;

• Podłoze TTC- szczepy redukujące TTC (chlorek 2,3,5-

trifenylotetrazoliowy) rosną w postaci bordowych
kolonii np. E. faecium (-) a E. faecalis (+);

• Podłoze SL;

Badanie wody wodociągowej- metoda płytkowa

głębinowa

1. Pobrad próbkę wody wodociągowej;
• W tym celu wylot kranu należy wymyd, wytrzed do sucha i opalid

palnikiem;

• Następnie spuszczad wodę z kranu przez 10 minut;
• Po tym czasie, nie zakręcając dopływu, pobrad około 200 ml wody do

jałowej kolby;

2.Oznaczyd liczbę bakterii psychrofilnych i mezofilnych;
• W tym celu na 2 płytki Petriego wlad po 1 ml i na kolejne 2 po 0,1 ml

pobranej wody;

• Na każdą z płytek wlad 20 ml upłynnionego agaru odżywczego

ostudzonego do temperatury 46⁰C.

• Całośd rozprowadzid równomiernie po powierzchni płytki;
• Po zakrzepnięciu dwie płytki inkubowad w 20⁰C (przez 72 godz.) i dwie w

37⁰C (przez 24 godz);

• Po inkubacji policzyd liczbę kolonii na płytkach i uśrednid. Porównad liczbę

psychrofili i mezofili;

• Wynik oznaczenia podad jako jtk/1 cm

3

Badanie wody wodociągowej- metoda

filtracyjno-membranowa

• Proces ten polega na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na

filtrze. Działa on na zasadzie sita i w związku z tym średnica porów filtra

musi byd mniejsza od średnicy komórek oraz form przetrwalnych.

Dodatkowo, częśd mikroorganizmów zatrzymywana jest przez siły

adsorpcyjne na powierzchni filtra;

• Do najczęściej stosowanych filtrów należą: filtry z ziemi okrzemkowej,

spiekanego szkła oraz filtry membranowe. Posiadają one zbyt małe pory,

aby filtrację można było przeprowadzid z wykorzystaniem siły ciężkości.

Konieczne jest więc zastosowanie nadciśnienia lub podciśnienia. Uzyskuje

się je za pomocą pompy próżniowej;

• Filtry membranowe są najczęściej stosowane. Charakteryzują się dużą

zdolnością filtracyjną. Są wykonane z estrów lub octanów celulozy,

polichlorku winylu lub teflonu o średnicy porów od 0,05 – 14,0 μm. Mają

postad cienkiej, sprężystej błony. Dzięki zastosowaniu różnicy ciśnieo (nad-

i podciśnienie) charakteryzują się dużą szybkością przepływu (40

cm3/min/cm2);

• Wynik badania należy podad w jednostkach tworzących kolonie (jtk)/ 100

cm

3

(wskaźnik coli)

• Zmontowad aparat filtracyjny-lejek umieścid na pompie

ssawkowej, która połączona jest za pomocą węża z kranem;

• Przy pomocy jałowej pincety przy zamkniętym kranie

nałożyd filtr celulozowy na porowatą płytkę, błyszcząca

względnie kratkowaną strona do góry;

• Wlad odpowiednią ilośd wody do lejka, otworzyd kran i

przefiltrowad próbkę;

• Zamknąd kran i jałową pincetą przenieśd filtr na

powierzchnię podłoża TTC i SL;

• Płytki umieśd w cieplarce w temp. 37C⁰C;
• Po okresie inkubacji policzyd wyrosłe kolonie- bakterie

redukujące TTC (chlorek 2,3,5- trifenylotetrazoliowy) rosną

w postaci bordowych kolonii;

2012-01-16

5

Badanie wody powierzchniowej- metoda

płytkowa głębinowa

• Oznaczenie liczby bakterii psychrofilnych i mezofilnych;
• Rozcieoczyd badaną wodę 10

-1

do 10

-6

;

• Po 1 ml rozcieoczeo od 10

-1

do 10

-4

wlad na płytki, po czym

na każdą z płytek wlad 20 ml upłynnionego agaru

odżywczego ostudzonego do temperatury 46⁰C.

• Całośd rozprowadzid równomiernie po powierzchni płytki;
• Po zakrzepnięciu dwie płytki inkubowad w 20⁰C (przez 72

godz.) i dwie w 37⁰C (przez 24 godz);

• Po inkubacji policzyd liczbę kolonii na płytkach i uśrednid.

Porównad liczbę psychrofili i mezofili;

• Wynik oznaczenia podad jako jtk/1 cm

3

Badanie wody powierzchniowej- metoda

fermentacyjno-probówkowa

•

Do probówek z rurkami Durhama odpowiednio ponumerowanych, zawierających po 10 ml
podłoża z laktozą i purpurą bromokrezolową, dodajemy:

•

1 ml wody rozcieoczonej 10-1

•

1 ml wody rozcieoczonej 10-2

•

1 ml wody rozcieoczonej 10-3

•

1 ml wody rozcieoczonej 10-4

•

1 ml wody rozcieoczonej 10-5

•

1 ml wody rozcieoczonej 10-6

•

Częśd probówek inkubowad w temperaturze 37⁰C, a częśd w 44⁰C. Obserwacje należy
przeprowadzid po 24 i 48 godz. inkubacji.

•

Zakwaszenie podłoża (zmiana barwy podłoża z fioletowej na żółtą) i obecnośd gazu w rurce

Durhama świadczą o występowaniu bakterii z grupy coli, przy czym jeśli takie zmiany podłoża
obserwuje się w probówkach inkubowanych w 44⁰C - bakterii z grupy coli typu fekalnego.
•

Ostatnia probówka w szeregu z wynikiem pozytywnym stanowi podstawę do oznaczenia miana
coli i miana coli typu fekalnego. Brak gazu i zakwaszenia po 48 godz. przyjmuje się jako wynik
ujemny.

2x