metody mikroskopowe w badaniach struktury... | laboratorium przemysłowe
dr Lesław Juszczak
Katedra Analizy i Oceny Jakości Żywności, Akademia Rolnicza w Krakowie
Metody mikroskopowe w badaniach
struktury produktów żywnościowych
Food microstructure is the organization of elements within food and their interaction. Knowledge of food microstructure is
critical if food features are to be controlled properly since there is a causal connection between structure and functionality.
Microscopy and imaging techniques are the most appropriate way for evaluating food structure because they are the
only analytical methods that produce results in the form of images. However visualization of true food structure is very
difficult, since step of the preparation of food sample for microscopy alters food structure to some extent.
Wykorzystanie technik mikroskopowych w nauce o żywności jest niero- żywności. Dopiero dalsze wykorzystanie mikroskopii świetlnej związane było
zerwalnie związane z jej mikrostrukturą, która określa stopień organizacji z analizą struktury żywności oraz wpływem procesów technologicznych na
poszczególnych komponentów żywności oraz ich wzajemne interakcje. jej przemiany. Mikroskopia świetlna charakteryzuje się jednak stosunkowo
Produkty żywnościowe charakteryzują się skomplikowaną strukturą, która niską rozdzielczością (około 200 nm), którą można dwukrotnie zwiększyć,
jest kreowana bÄ…dz
to przez samÄ… naturÄ™ (produkty nieprzetworzone), bÄ…dz
stosując promieniowanie nadfioletowe. Obecnie rozwój tradycyjnej mikro-
podczas procesów technologicznych. Wiele produktów żywnościowych skopii świetlnej dotyczy głównie poprawy jakości układów optycznych oraz
stanowi skomplikowane układy wielofazowe, emulsje, zawiesiny, piany, żele, dodatkowego oprzyrządowania mikroskopów (aparaty cyfrowe, kamery
a wzajemna organizacja oraz interakcje pomiędzy składnikami, tworząc CCD, oprogramowanie do analizy obrazów oraz ich archiwizacji). Przydat-
strukturę produktu, decydują o jej cechach funkcjonalnych. nym narzędziem mikroskopii świetlnej w analizie żywności są różnorodne
Techniki mikroskopowe to najodpowiedniejsze metody badania struktury techniki barwienia preparatów w celu ich skontrastowania. Należą do nich
żywności, ponieważ wynikiem eksperymentu są obrazy odzwierciedlające m.in. metody: tworzenie barwnego kompleksu skrobi z jodem oraz lokalizacja
jej budowę, a wykorzystanie takich metod jak cyfrowa analiza obrazu lub białek za pomocą fuksyny. Użytecznym barwnikiem w badaniu żywności
analiza fraktalna pozwala na matematyczny opis uzyskanych informacji. jest błękit toluidyny O (TBO), który barwi ściany komórkowe zawierające
Wiele przetworzonych produktów żywnościowych charakteryzuje się substancje pektynowe na kolor od różowego do purpurowego, natomiast
całkowicie odmienną strukturą w porównaniu do surowca, z którego
powstały (np. produkcja sera z mleka, chleba z ziarna pszenicy). W tym
przypadku analiza mikroskopowa jest pomocna w ocenie skuteczności
poszczególnych zabiegów technologicznych podczas procesu produkcyj-
nego i w kreowaniu odpowiedniej struktury  tekstury produktu.
Techniki mikroskopowe wykorzystuje się również w badaniu za-
nieczyszczeń i zafałszowań żywności. Zakres zastosowania technik
mikroskopowych w nauce o żywności obejmuje więc:
" badania związku pomiędzy strukturą a funkcjonalnymi właściwo-
ściami surowców, parametrami procesów technologicznych oraz
jakością surowców i wyrobów gotowych,
" badania przebiegu zmian strukturalnych podczas produkcji żywności,
" badania przyczyn zmian jakościowych w żywności w czasie transportu
i składowania,
" badania wpływu substancji obcych (zanieczyszczeń, dodatków do
żywności) na strukturę produktów.
Ciągły rozwój technik mikroskopowych powoduje coraz większe za-
interesowanie badaczy mikrostrukturą żywności oraz jej wpływem na
teksturę i inne cechy funkcjonalne żywności. Obserwacje rzeczywistej
struktury żywności są jednak trudne w realizacji, gdyż każde działanie
związane z przygotowaniem preparatu mikroskopowego w większym lub
mniejszym stopniu może wpływać na zmiany w jej strukturze, co w kon-
sekwencji może prowadzić do fałszywych wniosków. W tym przypadku
najwłaściwszym postępowaniem jest wykorzystanie kilku różnych technik
mikroskopowych i porównanie uzyskanych rezultatów.
Mikroskopia świetlna (LM  light microscopy)
Najwcześniej zastosowaną techniką mikroskopową w badaniu struktury
żywności była mikroskopia świetlna (optyczna). Początkowo technika ta
była wykorzystywana do obserwacji zanieczyszczeń i badania zafałszowań
Laboratorium | 4/2005
29
29
laboratorium przemysłowe | metody mikroskopowe w badaniach struktury...
w kompleksach z ligniną wykazuje barwę zawiera poświatę i zarysy szczegółów znajdują- następuje w polu elektrycznym. Koniecznym
ciemnoniebieską. W produktach mięsnych kom- cych się na różnych głębokościach preparatu, co warunkiem uformowania stabilnej wiązki jest
pleksy tkanka mięśniowa  TBO są bladoróżowe, znacznie utrudnia obserwację. próżnia. Elektrony pierwotne wysyłane przez
a włókna elastyny  turkusowe. emiter i przyspieszane w polu elektrycznym są
Inną odmianą mikroskopu świetlnego jest Mikroskopia konfokalna ogniskowane na badanym preparacie, a odchyla-
mikroskop polaryzacyjny, wykorzystywany do (CLSM  confocal laser nie ich przez cewkÄ™ skanujÄ…cÄ… pozwala na analizÄ™
badań układów krystalicznych w świetle linio- scanning microscopy) całej powierzchni próbki. Po zetknięciu się wiązki
wo spolaryzowanym. W obrazie mikroskopo- Mikroskop konfokalny (rys. 1) jest jedną z naj- elektronów z próbką następuje szereg zjawisk:
wym amorficzne obszary preparatu pozostają nowszych modyfikacji mikroskopii świetlnej absorpcja lub przejście (w przypadku cienkich
ciemne, natomiast rejony krystaliczne  jasne. (optycznej) i może być stosowany do obserwacji preparatów) elektronów przez próbkę (elektrony
Najlepszym przykładem są tutaj ziarna skrobio- z użyciem konwencjonalnej fluorescencji, jak pierwotne nierozproszone i rozproszone), odbi-
we, zawierające zarówno obszary amorficzne, również w świetle odbitym, generowanym cie elektronów (elektrony pierwotne wstecznie
jak i krystaliczne. W tym przypadku mikroskop z płaszczyzny fokalnej próbki. Zasadnicze rozproszone) i emisja elektronów wtórnych oraz
polaryzacyjny można wykorzystać do badania modyfikacje polegają na tym, że wiązka światła promieniowania rentgenowskiego. W zależności
procesu kleikowania skrobi. ogniskowana przez obiektyw wybiórczo oświe- od sposobu powstawania obrazu wyróżnia się
Kolejną techniką mikroskopową wykorzystywaną tla obszar na określonej głębokości preparatu, transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM)
w badaniach struktury żywności jest mikroskopia a światło odbite od tego obszaru (lub emitowane oraz skaningową mikroskopię elektronową
fluorescencyjna. Opiera siÄ™ ona na pomiarach przez wzbudzony fluorochrom) jest ogniskowa- (SEM). W mikroskopie transmisyjnym obraz
fluorescencji barwników fluorescencyjnych (flu- ne w cienką wiązkę przepuszczaną przez aperturę powstaje na skutek ugięcia zogniskowanej
orochromów), które wybiórczo mogą się wiązać konfokalną (mały otwór w przesłonie znajdującej wiązki elektronów, które jest wynikiem ich
z wybranymi strukturami subkomórkowymi lub się pod detektorem światła), co umożliwia jed- interakcji z chmurą elektronową otaczającą
grupami chemicznymi. Zjawisko fluorescencji noczesne eliminowanie promieni pochodzących atomy próbki. Następuje również redukcja
jest określane jako zdolność do emitowania z innych płaszczyzn. Dodatkowo, przesuwając szybkości elektronów. Niewielka ilość elektro-
światła o określonej długości fali pod wpływem próbkę w osi Z, otrzymuje się obrazy poszcze- nów, penetrując chmurę elektronową atomu,
absorpcji promieniowania pochodzącego z ob- gólnych płaszczyzn. Cały układ wspomagany jest uginana pod znacznie większym kątem
cego z
ródła. W mikroskopie fluorescencyjnym jest oprogramowaniem, które analizuje nie tylko i nie trafia na soczewkę obiektywu, dając od-
preparat napromieniowuje się światłem o okre- jasność i barwę wszystkich punktów, ale również powiednio ciemne punkty na ekranie. Schemat
ślonej długości fali z wydzielonego przez filtry ich położenie na płaszczyz
nie X-Y oraz na transmisyjnego mikroskopu elektronowego
wzbudzające widma lampy. Wiele składników głębokości (Z). W mikroskopach konfokalnych przedstawiono na rysunku 2. W mikroskopie
żywności wykazuje autofluorescencję. Należą jako z
ródło światła stosuje się lasery (argonowe, transmisyjnym o zdolności rozdzielczej decyduje
do nich: chlorofil, karotenoidy, ligniny, kolagen, kryptonowo-argonowe, helowo-neonowe), dzięki w znacznej mierze grubość preparatu, która
elastyna oraz niektóre tłuszcze. Stosowanie trady- czemu można znacznie zmniejszyć wiązkę powinna wynosić około 20 nm dla osiągnięcia
cyjnej mikroskopii fluorescencyjnej związane jest oświetlającą, co w konsekwencji powoduje zdolności rozdzielczej rzędu 2 nm.
jednak ze skomplikowanymi procedurami przy- wzrost intensywności świecenia. Mikroskopia W skaningowym mikroskopie elektronowym
gotowania preparatów. Warunkiem otrzymania konfokalna znajduje szerokie zastosowanie (rys. 3) sygnał z powierzchni próbki stanowią
obrazu o dobrej jakości (wysokiej rozdzielczości w analizie struktury produktów żywnościowych, elektrony wtórne lub pierwotne odbite (wstecz-
i właściwym kontraście) jest odpowiednia gru- szczególnie tych o dużej zawartości tłuszczu nie rozproszone). Docierają one do detektora,
bość preparatu. W przypadku gdy preparat jest (masło, tłuszcze śniadaniowe, majonez, sosy którego istotną część stanowią scyntylator i fo-
zbyt gruby, otrzymany obraz mikroskopowy sałatkowe) oraz układów wielofazowych. Przy- topowielacz. Obrazy mikroskopowe wykonane
kładem może być tutaj krem na bazie mleka, w skaningowym mikroskopie elektronowym
do którego podczas ubijania wtłaczane jest
powietrze. Wykorzystanie mikroskopu konfo-
kalnego pozwoliło zaobserwować, że banieczki
powietrza stabilizowane sÄ… otaczajÄ…cymi je
kuleczkami tłuszczowymi, a pozostałą przestrzeń
wypełnia matryca białkowa. Szczegółowa analiza
takiego układu pozwala zaobserwować korelacje
pomiędzy rozmiarami i dystrybucją poszczegól-
nych komponentów a cechami strukturalnymi
i funkcjonalnymi gotowego produktu.
Mikroskopia elektronowa
(EM  electron microscopy)
Podstawą tej techniki jest bombardowanie próbki
wiązką elektronów, której z
ródłem jest katoda
Rys. 1. Schemat optyki mikroskopu konfo- Rys. 2. Schemat budowy układu tworzącego obraz
dostarczajÄ…ca czÄ…stki w wyniku termoemisji lub
kalnego. w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.
emisji polowej. Przyspieszenie wiązki elektronów
Laboratorium | 4/2005
30
metody mikroskopowe w badaniach struktury... | laboratorium przemysłowe
Fot. 1. Fragment powierzchni ziarna skrobi Fot. 2. Mikrostruktura liofilizowanego żelu
ziemniaczanej (B. Trybalska, AGH, Kraków). skrobiowego (B. Trybalska, AGH, Kraków).
Rys. 3. Schemat budowy układu tworzącego ob-
węgla i złota lub platyny. Pozostałe surowce lub octanie uranylu). Zjawisko emisji promienio-
raz w skaningowym mikroskopie elektronowym.
i produkty żywnościowe wymagają bardziej wania rentgenowskiego jako efekt oddziaływania
przedstawiają topografię powierzchni próbki. skomplikowanych procedur przygotowania elektronów z atomami analizowanego materiału
W mikroskopii elektronowej niezmiernie preparatów, które obejmują: utrwalanie z wyko- jest podstawą mikroanalizy rentgenowskiej.
istotnym zagadnieniem jest technika przygo- rzystaniem aldehydów (formaldehyd, aldehyd Wykorzystuje się tu zależność energii i natężenia
towywania preparatów. Wybór metody prepa- glutaronowy), manganianu(VII) potasu lub promieniowania charakterystycznego od składu
rowania zależny jest od rodzaju mikroskopu tetrachlorku osmu, płukanie, odwadnianie chemicznego badanego mikroobszaru preparatu.
oraz specyfiki analizowanego materiału. Takie w roztworach etanolu lub acetonu i suszenie. Tak Przykładowe obrazy uzyskane z wykorzystaniem
produkty żywnościowe, jak ziarna zbóż, nasiona przygotowane preparaty napyla się warstwą prze- skaningowej mikroskopii elektronowej pokazano
roślin strączkowych oraz produkty ich przero- wodnika i poddaje analizie w mikroskopie SEM. na fotografiach 1-4. Fotografia 1 przedstawia
bu, żywność sproszkowana czy koncentraty, Natomiast w przypadku mikroskopii TEM pre- fragment powierzchni ziarna skrobi ziemniacza-
ze względu na niską wilgotność nie wymagają paraty poddawane są dalszej obróbce: zatapianiu nej. Obserwowane uszkodzenie jest wynikiem
wstępnego przygotowania do analizy w SEM. w żywicach (metakrylany, żywice epoksydowe), działania wiązki elektronów w komorze mikro-
Niewielkich rozmiarów preparaty napyla się cięciu ultracienkich skrawków w mikrotomach skopu. Na fotografii 2 pokazano nieregularną
w napylarkach próżniowych cienką warstwą oraz kontrastowaniu (np. w cytrynianie ołowiu strukturę liofilizowanego żelu skrobiowego.
Laboratorium | 4/2005
31
31
laboratorium przemysłowe | metody mikroskopowe w badaniach struktury...
zastosowaniu specjalnego gazowego detektora
elektronów wtórnych (GSED). Pozwala to na
obserwacje materiałów biologicznych, w tym
próbek żywności, bez wcześniejszych zabiegów
związanych z przygotowaniem preparatów. Daje
to możliwość obserwacji rzeczywistej struktury
próbek o dużej zawartości wody (np. struktury
żelowe i żelopodobne, lody).
Mikroskopia sił
Fot. 5. Powierzchnia ziarna skrobiowego
Fot. 3. Mikrostruktura matrycy białkowej jogur-
(F. Krok, UJ, Kraków).
atomowych
tu z mleka koziego (J. Domagała, AR, Kraków).
(AFM  atomic force
microscopy)
Mikroskop sił atomowych należy do grupy
skaningowych mikroskopów próbkujących
(SPM), zwanych również mikroskopami sond
skanujÄ…cych. ZasadniczÄ… zaletÄ… tej mikroskopii
jest możliwość badania materiałów nieprze-
wodzących, a więc próbek biologicznych, bez
wstępnego ich preparowania. Obrazy uzyskane
z wykorzystaniem mikroskopii AFM odzwiercie-
Fot. 6. Mikrostruktura powierzchni czekolady
dlają strukturę powierzchniową próbki w skali
(A. Ptaszek, AR, Kraków).
nanometrycznej. W mikroskopie sił atomowych
Fot. 4. Mikrostruktura matrycy białkowej
sera miękkiego (J. Domagała, AR, Kraków).
próbnik skanujący powierzchnię próbki umiesz-
czony jest na wsporniku (rys. 4). Oddziaływania
na poziomie sił van der Waalsa pomiędzy po-
wierzchnią próbki a próbnikiem powodują jego
ugięcie lub odchylenie, co jest rejestrowane przez
detektor i przekształcane w obraz powierzchni.
Mikroskopy AFM mogą pracować w trzech
Fot. 7. Mikrostruktura powierzchni czekolady
trybach. W trybie kontaktowym odległość
(A. Ptaszek, AR, Kraków).
pomiędzy powierzchnią próbki a próbnikiem
wynosi ułamek nanometra, natomiast w bezkon- znalazła zastosowanie do lokalizacji cząsteczek
taktowym  kilkanaście nanometrów. Trzeci tryb wody i tłuszczu w produktach żywnościowych
pracy mikroskopu AFM   tapping  stanowi oraz badania zjawiska krystalizacji tłuszczu. Ko-
Rys. 4. Schemat budowy układu tworzącego
pośrednią metodę w stosunku do dwóch pozo- lejną bezinwazyjną techniką, która może znalez
ć
obraz w mikroskopie sił atomowych.
stałych. Dodatkową zaletą mikroskopii AFM zastosowanie w badaniu struktury żywności, jest
Mikrostrukturę jogurtu oraz sera miękkiego jest możliwość pracy w roztworach. Przykładowe mikroskopia akustyczna.
pokazano na fotografiach 3 i 4. PrzedstawiajÄ… obrazy mikrostruktury powierzchniowej poka-
Piśmiennictwo
one przestrzenną sieć strukturalną zbudowaną zano na fotografiach 5-7. Fotografia 5 przed-
1. Aguilera J.M., Why food microstructure?  Journal of Food
z miceli kazeinowych. Dodatkowo na fotografii 4 stawia obraz powierzchni ziarna skrobiowego,
Engineering , 2005, 67, 3-11.
2. Aguilera J.M., Stanley D.W., Baker K.W., New dimensions in
można zaobserwować obecność bakterii fermen- natomiast fotografie 6 i 7 obrazują strukturę
microstructure of food products.  Trends in Food Science
tacyjnych w postaci łańcuszka paciorków. powierzchniową czekolady.
and Technology , 2000, 11, 3-9.
Próbki żywności o wysokiej zawartości wody Dalszy rozwój i wykorzystanie technik mikro- 3. Barbacki A. (red.), Mikroskopia elektronowa. Wydawnictwo
Politechniki Poznańskiej, Poznań, 2003.
lub tłuszczu, z których trudno przygotować skopowych w badaniu struktury żywności mogą
4. Brooker B.E., The study of food systems using confocal laser
preparaty do analizy z wykorzystaniem trady- być również związane z zastosowaniem technik scanning microscopy.  Microscopy and Analysis . 1991, 13-15.
5. Dürrenberger M.B., Handschin S., Conde-Petit B., Escher F., Visu-
cyjnej mikroskopii SEM, mogą być obserwo- zespolonych, np. połączenie mikroskopii optycz-
alization of food structure by confocal laser scanning microscopy
wane po wstępnym zamrożeniu poniżej -80oC nej z metodami spektroskopowymi (absorpcja (CLSM).  Lebensm.-Wiss. u.-Technol. , 2001, 34, 11-17.
6. Fornal J., Aktualny stan metod badawczych żywności w dziedzi-
(cyro-SEM). W tym przypadku niezmiernie UV, mikrospektroskopia w podczerwieni z trans-
nie mikroskopii elektronowej. [W:] Postępy w Analizie Żywności
ważne są wielkość próbki, szybkość zamrażania formacją Fouriera), co pozwala na lokalizację
(Tyszkiewicz S., red), tom II, Warszawa, 1990, 147-154.
7. Fornal J., Błaszczak W., Mikrostruktura a funkcjonalne właści-
i temperatura, gdyż formowanie kryształów i mapowanie specyficznych grup chemicznych.
wości żywności.  Przemysł Spożywczy , 2001, 55, 8, 34-37.
lodu może w znacznym stopniu wpływać na Natomiast zespolenie mikroskopii z reometrami
8. Kaláb M., Allan-Wojtas P., Shea Miller S., Microscopy and
other imaging techniques in food structure analysis.  Trends
zmiany wyjściowej struktury materiału. Jedną pozwala na obrazowanie zmian strukturalnych
in Food Science and Technology , 1995, 6, 177-185.
z nowszych modyfikacji SEM jest środowiskowy indukowanych przyłożonymi naprężeniami. No-
9. Kirby A.R., Gunning A.P., Morris V.J., Atomic force microsco-
py in food research: A new technique comes of age.  Trends
( mokry ) skaningowy mikroskop elektronowy woczesnÄ… technikÄ… opartÄ… na bazie spektroskopii
in Food Science and Technology , 1995, 6, 359-365.
(ESEM). Mikroskop ten pracuje w środowisku NMR jest obrazowanie rezonansu magnetycz-
10. van de Velde F., Tromp H., What does mouth feel look like?
 Food Engineering & Ingredients , 2002, 27, 6, 38-43.
pary wodnej, a obraz próbki powstaje dzięki nego (MRI), która jako metoda bezinwazyjna
Laboratorium | 4/2005
32