WĘGLOWODANY

1. Wykrywanie węglowodanów (reakcja Molischa)

Zasada:

Jest to najbardziej ogólna reakcja charakterystyczna, którą wykazują wszystkie cukrowce. Pod

wpływem stężonego kwasu siarkowego pierścieniowe formy cukrów ulegają odwodnieniu

tworząc furfural (pentozy) lub 5-hydroksymetylofurfural (heksozy) (Rys. 1). Związki te reagują

z α-naftolem lub benzydyną, dając barwne połączenia.

Rys. 1. Reakcja odwodnienia pentoz i heksoz

Wykonanie:

Do probówek zawierających 1 cm

3

różnych cukrów prostych i złożonych (glukoza, fruktoza,

ryboza, sacharoza, skrobia) dodać 1–2 krople odczynnika Molischa, czyli świeżo

przygotowanego 10-procentowego alkoholowego roztworu α-naftolu (benzydyny). Zawartość

probówki wymieszać, po czym lekko przechylić i po ściance nalać 1 cm

3

stężonego kwasu

siarkowego (OSTROŻNIE!), tak by obydwie ciecze nie zmieszały się. Na granicy faz pojawia

się czerwony lub czerwonofioletowy pierścień.

2. Wykrywanie ketoz (Reakcja Seliwanowa)

Zasada:

Pierścieniowe formy cukrów ulegają odwodnieniu pod wpływem mocnych kwasów, tworząc

furfural (pentozy) lub 5-hydroksymetylofurfural (heksozy). Hydroksymetylofurfural tworzy

następnie barwne połączenie z rezorcyną. Jednakże pod wpływem rozcieńczonego kwasu solnego

odwadnianie ketoz następuje znacznie szybciej aniżeli aldoz, co jest podstawą ich odróżniania.

Rys. 2. Wzór strukturalny A. α-D-fruktozy (ketozy) i B. α-D-glukozy (aldozy)

A. B.

Wykonanie:

Do probówek zawierających oddzielnie po 1 cm

3

roztworów A, B, C, które zawierają cukier dodać

po 1 cm

3

odczynnika Seliwanowa (skład odczynnika: 100 cm

3

stężonego kwasu solnego, 300 cm

3

wody, 150 mg rezorcyny) i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej. W przypadku ketozy po ogrzewaniu

przez ok. 0,5-1 min roztwór zabarwia się na kolor czerwony. Aldoza może również tworzyć

podobnie zabarwione połączenie z rezorcyną, jednakże po znacznie dłuższym ogrzewaniu.

3. Reakcja Biala wykrywająca pentozy (odróżnianie pentoz od heksoz)

Zasada:

Pierścieniowe formy cukrów ulegają odwodnieniu pod wpływem mocnych kwasów, tworząc

furfural (pentozy) lub 5-hydroksymetylofurfural (heksozy). Furfural daje z orcyną w obecności

jonów żelazowych zielone lub zielono-niebieskie zabarwienie, podczas gdy 5-

hydroksymetylofurfural w tych warunkach daje roztwór zabarwiony na żółto-brązowy kolor.

Wykonanie:

Do 3 probówek nalać po 2 cm

3

odczynnika Biala (skład odczynnika: 500 cm

3

stężonego HCl, 500

cm

3

H

2

O, 1 g orcyny, 20 kropli 10% wodnego roztworu FeCl

3

) i ogrzewać na łaźni wodnej w

temperaturze 90°C przez ok. 3 min, a następnie dodać do każdej probówki oddzielnie po 1 cm

3

analizowanych roztworów A, B, C, zawierających glukozę, fruktozę lub rybozę). Zamieszać i

wstawić do łaźni wodnej. Po kilku minutach zanotować powstające zabarwienie.

Na podstawie wyników reakcji 2 i 3 zidentyfikować cukry A, B, C spośród wymienionych

powyżej.

4. Odróżnianie cukrów redukujących od nieredukujących (reakcja Benedicta)

Zasada:

Cukry o właściwościach redukujących mają zdolność redukowania jonów miedzi Cu

2+

do jonów

Cu

+

o charakterystycznej, czerwonopomarańczowej barwie tlenku Cu

2

O (Rys. 3). Właściwości

redukcyjne charakteryzują tylko te cukry, które posiadają wolny węgiel z grupą aldehydową lub

ketonową, a więc wszystkie monosacharydy i te spośród oligosacharydów, które mają wolny

przynajmniej jeden węgiel półacetalowy (czyli węgiel karbonylowy, uczestniczący w tworzeniu

formy pierścieniowej cząsteczki) (Rys. 4).

Rys. 3. Reakcja redukcji jonów miedzi pod wpływem dowolnego cukru prostego

Rys. 4. Wzory strukturalne redukujących cukrów: glukozy, maltozy i celobiozy z zaznaczeniem

wolnego węgla półacetalowego, oraz sacharozy z zaznaczeniem zablokowanego węgla

półacetalowego w wiązaniu glikozydowym.

Wykonanie:

Do dwóch probówek odmierzyć po 1 cm

3

cukrów D i E (sacharozy lub maltozy), a następnie dodać

po 2,5 cm

3

odczynnika Benedicta (skład odczynnika: 173 g cytrynianu sodowego, 100 g

bezwodnego węglanu sodowego, 800 cm

3

wody + roztwór 17,3 g CuSO

4

w 100 cm

3

wody

uzupełnić wodą do 1 dm

3

), i ogrzewać na łaźni wodnej w temperaturze 60°C przez kilka minut. W

obecności cukru redukującego wytwarza się ceglastoczerwony osad. Przy mniejszej zawartości

cukru może powstać jedynie zielone zabarwienie albo osad o barwie od żółtej do pomarańczowej.

Na podstawie wyników reakcji 4 rozróżnić cukry D i E spośród wymienionych

Sprawozdanie:

Podać jakie związki były oznaczone literami A, B, C, D, E i na jakiej podstawie poszczególne

cukry zostały rozróżnione.

5. Hydroliza skrobi

a. Otrzymywanie skrobi z ziemniaka

Zasada:

W metodzie tej wykorzystuje się znaczny ciężar właściwy ziaren skrobiowych, które uwolnione z

komórek łatwo sedymentują.

Wykonanie:

Kilka ziemniaków umyć, obrać, zetrzeć na miazgę i rozcieńczyć równą objętością wody. Tkankę

odcisnąć przez kilka warstw gazy, a roztwór odwirować przy ok. 1000 obr./min przez 5 min. Zlać

ciecz znad osadu, a skrobię przepłukać etanolem i wysuszyć na bibule.

b. Hydroliza skrobi i próba jodowa

Zasada:

Cząsteczki glukozy tworzą w cząsteczce skrobi rozgałęzione helisy. Do wnętrza tych helis może

wnikać jod, rozmieszczając się regularnie po 1 atomie na 1 skręt helisy. Powoduje to powstanie

zabarwionego kompleksu jodowo-skrobiowego o barwie od fioletowo-czerwonej (amylopektyna)

do niebieskiej (amyloza). Po ogrzaniu zabarwienie znika z powodu rozkręcania się helis i rozpadu

kompleksu. Procesowi postępującej hydrolizy skrobi towarzyszy stopniowa zmiana barwy z nie-

bieskiej w fioletową, czerwoną i ostatecznie jej zanik.

Rys. 5. Wiązania glikozydowe występujące w amylozie i amylopektynie

Rys. 6. Zwinięty przestrzennie łańcuch amylozy, tworzący pętle

Wykonanie:

Przygotowanie kleiku skrobiowego: 3 g skrobi rozmieszać w 50 cm

3

zimnej wody destylowanej.

150 cm

3

wody zagotować. Do gotującej wody powoli wlewać rozmieszana skrobię ciągle

mieszając. Kleik gotować przez 1 minutę. Ostudzić.

Przygotować 10 probówek zawierających po 1 cm

3

0,002% roztworu Lugola (jod w jodku potasu).

Do ok. 10 cm

3

kleiku skrobiowego otrzymanego ze skrobi wyizolowanej w części a) dodać 1 cm

3

stężonego kwasu solnego i ogrzewać na łaźni wodnej. Co ok. 1 min pobierać kilka kropel kleiku i

wlewać do kolejnej probówki. Obserwować postępującą hydrolizę skrobi i wywołaną tym zmianę

zabarwienia w kolejnych probówkach.

6. Oznaczanie zawartości cukrów rozpuszczalnych w tkankach roślinnych metodą

antronową

Sporządzenie krzywej kalibracyjnej

Przygotować wzorcowy roztwór glukozy o stężeniu 1 mg/cm

3

(Przykładowo 10 mg glukozy

rozpuścić w 10 cm

3

). Przygotować 5 probówek dla wzorcowych roztworów glukozy o stężeniu

0,2; 0,1; 0,05; 0,025 i 0,0125 mg glukozy w 1 cm

3

. Do pierwszej probówki pobrać 2 cm

3

wzorca

o stężeniu 1 mg/cm

3

i uzupełnić 8 cm

3

wody, uzyskując w ten sposób stężenie glukozy 0,2

mg/cm

3

. Zamieszać. Z probówki tej pobrać 3 cm

3

roztworu glukozy do następnej probówki i

dodać 3 cm

3

wody, uzyskując rozcieńczenie wynoszące 0,1 mg/cm

3

. Powtarzając postępowanie

uzyskujemy kolejne rozcieńczenia. Następnie pobrać do 5 nowych probówek po 1 cm

3

każdego

z rozcieńczeń. Do każdej z nich dodać 2 cm

3

0,2% antronu w stężonym H

2

SO

4

, zmieszać

roztwór na wstrząsarce laboratoryjnej i ogrzewać przez 3 minuty na łaźni wodnej o temperaturze

90



C. Po ostygnięciu próbek do temperatury pokojowej zmierzyć w szklanych kuwetkach

spektrofotometrycznych absorbancję (ABS) przy



= 620 nm względem ślepej próby (zamiast

roztworu cukru z roztworem antronu zmieszać 1 cm

3

wody).

Krzywą wzorcową uzyskać w arkuszu Excela. Na podstawie danych dotyczących absorbancji

dla kolejnych stężeń glukozy sporządzić wykres punktowy, wstawić linię trendu i odczytać

równanie y = ax + b, gdzie y oznacza ABS, a – współczynnik (tangens kąta nachylenia krzywej

w stosunku do osi OX), x – stężenie cukru w mg/cm

3

, b – punkt przecięcia linii trendu z osią

OY. Jeżeli założymy, że zerowe stężenie cukru daje ABS=0, współczynnik b będzie też równał

się zero. Na rys. 7. przedstawiono przykładowa krzywą wzorcową.

Rys. 7. Przykładowy wykres krzywej wzorcowej

Oznaczenie zawartości cukrów rozpuszczalnych w materiale roślinnym

Ekstrakcja cukrów rozpuszczalnych

Pobrać dwukrotnie po 0,5 g świeżej masy liścia i każdą z prób utrzeć oddzielnie w moździerzu w

ciekłym azocie. Po odparowaniu azotu, podczas ucierania dodawać stopniowo 5 cm

3

wody.

Homogenat przenieść do szklanej probówki, a moździerz przepłukać jeszcze 5 cm

3

wody i zlać

je również do homogenatu w probówce. Próbki gotować przez 15 minut na wrzącej łaźni

wodnej, a następnie zawartość przenieść dokładnie do probówek wirówkowych. Tkankę

odwirować przez 10 minut przy 15 000 obr./min. Nadsącz zlać do nowej probówki i uzupełnić

wodą do 10 cm

3

.

Oznaczanie zawartości cukrów rozpuszczalnych

Pobrać 0,5 cm

3

nadsączu i rozcieńczyć go dodając 9,5 cm

3

wody. Stopień rozcieńczenia należy

dobrać tak, by odczytywane wartości absorbancji mieściły się w zakresie krzywej kalibracyjnej.

Rozcieńczony ekstrakt wymieszać na wstrząsarce laboratoryjnej i pobrać z niego dwukrotnie po

1 cm

3

. Do każdej z probówek dodać po 2 cm

3

0,2% antronu w stężonym H

2

SO

4

(POCh),

wstrząsnąć probówkę na wstrząsarce i ogrzewać przez 3 minuty na łaźni wodnej o temperaturze

90



C. Po ostygnięciu próbki do temperatury pokojowej zmierzyć absorbancję przy



= 620 nm

względem ślepej próby (zamiast roztworu cukru z roztworem antronu zmieszać 1 cm

3

wody).

Wartość zmierzonej absorbancji próbek wstawić do wzoru uzyskanego w punkcie a. Wyliczyć

wartość stężenia cukru (x) w mg/cm

3

roztworu. Chcąc wyznaczyć zawartość cukru w liściu czyli

w mg/g świeżej masy należy wartość wyliczonego stężenia x pomnożyć przez objętość

wyjściowego roztworu (tj. 10 cm

3

). Otrzymujemy w ten sposób zawartość cukru w całej

objętości tego roztworu. Roztwór ten powstał z homogenizacji 0,5 g liścia, chcąc zatem

otrzymać zawartość cukru w liściu w przeliczeniu na 1 g świeżej masy, należy uzyskany wynik

podzielić przez masę próbki liścia tj,. 0,5 g.

Sprawozdanie

a) Opisać zabarwienie w próbówkach na poszczególnych etapach hydrolizy skrobi.

b) Za pomocą arkusza kalkulacyjnego MS Excel wykreślić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć

równanie regresji liniowej zależności absorbancji od stężenia glukozy (wzorca) w próbce.

c). Obliczyć stężenie cukru z pomocą równania regresji liniowej otrzymanego w podpunkcie a).

Następnie stężenie cukru w próbce przeliczyć na jego zawartość w świeżej masie liścia.

7. Oznaczanie zawartości ketoz

Wykonanie:

Odważoną tkankę roślinną homogenizować dodając stopniowo 5 cm

3

wody destylowanej.

Ekstrakt odwirować przez 20 min przy 4000 obr./min, po czym zlać supernatant. W celu

strącenia białek do 2,5 cm

3

supernatantu dodać 0,5 cm

3

bezwodnego octanu cynku (230g · dm

-3

)

oraz 0,5 cm

3

żelazocjanku potasu (150g · dm

3

), zmieszać na wstrząsarce laboratoryjnej oraz

odwirować.

Do supernatantu odpowiednio rozcieńczonego wodą do objętości 1 cm

3

dodać 1,5 cm

3

5%

rezorcyny w etanolu i 1,5 cm

3

(NH

4

)

2

Fe(SO

4

)

2

w HCl. Po wymieszaniu na wstrząsarce

laboratoryjnej próbki wstawić do łaźni wodnej o temp. 80°C na 40 minut. Po schłodzeniu próbek

w lodzie, zmierzyć absorbancję przy długości fali λ = 480 nm. Stężenie cukru obliczyć na

podstawie krzywej kalibracyjnej przygotowanej dla roztworu fruktozy.

8. Oznaczanie zawartości skrobi

Ekstrakcja i hydroliza enzymatyczna

Osad pozostały z wirowania w podpunkcie 6b rozpuścić w 5 cm

3

0,2 mol/dm

3

KOH i przenieść

do szklanej probówki. Gotować 30 minut na wrzącej łaźni wodnej utrzymując poprzez

dolewanie wody stałą objętość próbki (poziom cieczy należy zaznaczyć). Po ochłodzeniu ustalić

pH w probówce na 5,5 przez dodanie 1 cm

3

kwasu octowego o stężeniu 1 mol/dm

3

. Następnie

dodać 5 cm

3

dializowanej amyloglukozydazy (z Aspergillus oryzae, firmy SIGMA) (enzym

rozpuścić w proporcjach 35 U/cm

3

50 mM buforu octanowego o pH 4,5, wlać do woreczka

dializacyjnego, i umieścić go w zlewce z wodą destylowaną na całą noc) i inkubować probówki

30 minut w 55°C. Następnie próbkę zagotować (by unieczynnić enzym), przelać do probówki

wirówkowej i odwirować przez 10 minut przy 15 000 obr/min. Supernatant zlać i uzupełnić

wodą do 10 cm

3

.

Oznaczanie zawartości skrobi w równoważnikach glukozy

Postępować analogicznie jak w punkcie 6b, przy oznaczaniu zawartości cukrów

rozpuszczalnych.

Piśmiennictwo:

Ashwell G., 1975. Colorimetric analysis of sugars. Methods Enzymol., 3: 467-471.

Rufty W.T. jr. and Huber S.C. 1983. Changes in starch formation and activities of sucrose

phosphate synthase and cytoplasmic fructose-1,6-biphosphatase in response to source-sink

alterations. Plant Physiol., 72, 474-480.

9. Rozpuszczanie celulozy w odczynniku Schweitzera

Zasada:

Celuloza różni się od skrobi przede wszystkim tym, że cząsteczki glukozy połączone są wiązaniami

β-glikozydowymi zamiast α (Rys. 8). Konsekwencją tego faktu jest bardzo duża odporność celulozy

na działanie czynników hydrolizujących, rozpuszczających oraz na rozkład enzymatyczny. Dopiero

stężone kwasy oraz takie specyficzne rozpuszczalniki jak odczynnik Schweitzera rozpuszczają

celulozę.

Rys. 8. Wzór strukturalny fragmentu łańcucha ligniny

Wykonanie:

Kawałek bibuły, strzępek waty lub skrawek płótna zalać pod wyciągiem 50 cm

3

odczynnika

Schweitzera (do 50 cm

3

0,3 M roztworu CuSO

4

dolać mieszając 50 cm

3

0,6 M NaOH, wytrącony

osad rozpuścić w 75 cm

3

28% roztworu amoniaku) po czym mieszać do rozpuszczenia. Po wlaniu

tego roztworu do rozcieńczonego kwasu solnego (10 cm

3

stężonego kwasu rozcieńczyć 90 cm

3

wody) celuloza ponownie się wytrąca. Jeśli roztwór celulozy wytłaczać przez bardzo wąskie dysze,

wówczas może w ten sposób powstać sztuczne włókno celulozowe.

UWAGA! Stężony roztwór amoniaku drażni drogi oddechowe, stąd eksperyment należy

wykonywać koniecznie pod sprawnym wyciągiem.

LIPIDY

Najczęściej stosowane metody chromatograficzne w analizie ilościowej i jakościowej

lipidów

Termin chromatografia oznacza efekt rozdziału (separacji) mieszaniny substancji na jej

składniki, obserwowany podczas przepływu fazy ruchomej wzdłuż powierzchni fazy

nieruchomej. Cząsteczki składników mieszaniny, które słabo oddziałują z fazą nieruchomą, są

szybciej unoszone przez płynącą fazę ruchomą, zaś cząsteczki przyciągane mocniej poruszają się

wolniej. Fazą ruchomą może być gaz lub ciecz, zaś fazą nieruchomą - ciecz, żel lub porowate

ciało stałe. Zastosowanie chromatografii w analityce chemicznej polega na separacji mieszaniny

substancji (związków chemicznych) na proste składniki, a następnie na pomiarze ich ilości.

Wykorzystywanie różnych faz ruchomych i nieruchomych, oraz odmiennych co do

fizykochemicznej natury oddziaływań powodujących rozdział chromatograficzny, doprowadziło

do powstania wielu różnych technik chromatograficznych.

Chromatografia gazowa (GC - gas chromatography)

Jest to metoda analityczna wykorzystująca efekt rozdziału chromatograficznego z użyciem gazu

(np. He) jako fazy ruchomej, oraz porowatego ciała stałego lub filmu polimeru organicznego

jako fazy nieruchomej. Stosowana do analiz składu złożonych mieszanin związków

chemicznych, zwłaszcza lotnych związków organicznych i nieorganicznych.

Najważniejsze elementy chromatografu gazowego to dozownik, służący do wprowadzenia

próbki do strumienia gazu nośnego, kolumna analityczna zawierająca fazę stacjonarną oraz

detektor. Kolumna chromatograficzna ma postać długiej i cienkiej rurki (stalowej, kwarcowej

lub szklanej), zwiniętej w zwój. W kolumnie kapilarnej faza stacjonarna tworzy cienką warstwę

na wewnętrznej powierzchni ścianek. Kolumna jest umieszczona w termostatowanym piecu,

wyposażonym w programator temperatury. W chromatografii gazowej najczęściej

wykorzystywane są detektory przewodnictwa cieplnego (TCD, HWD), detektory płomieniowo-

jonizacyjne (FID), detektory wychwytu elektronów (ECD) oraz detektory masowe (MSD).

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC - high performance liquid chromatography)

Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest uniwersalną metodą analityczną, stosowaną

głównie do analiz złożonych próbek, zwłaszcza zawierających nielotne, wielkocząsteczkowe

związki chemiczne, w szczególności substancje biologicznie czynne. Metoda HPLC

wykorzystuje efekt rozdziału chromatograficznego z użyciem cieczy jako fazy ruchomej. Skład

fazy ciekłej i rodzaj fazy stacjonarnej jest uzależniony od składu badanych próbek oraz typu

oddziaływań

wykorzystywanych

do

osiągnięcia

separacji

ich

składników.

Typowy zestaw do HPLC składa się ze zbiornika fazy ciekłej (eluentu), pompy, dozownika,

kolumny analitycznej, detektora i zbiornika na zużyty eluent. Zbiornik eluentu jest często

wyposażony w urządzenia do odpowietrzania i filtrowania cieczy. Najczęściej stosowane

mechaniczne pompy tłokowe umożliwiają osiąganie bardzo wysokich ciśnień i stabilnych

szybkości przepływu. Jako dozowniki zwykle wykorzystywane są zawory z pętlą dozującą o

określonej objętości. Kolumny analityczne to rurki stalowe wypełnione cząstkami fazy

stacjonarnej. Do detekcji składników opuszczających kolumnę najczęściej stosuje się detektory

absorpcji promieniowania UV-VIS, detektory fluorescencyjne, detektory refraktometryczne oraz

detektory

elektrochemiczne

(polarograficzne,

woltamperometryczne,

kulometryczne,

konduktometryczne).

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC - thin layer chromatography)

Chromatograficzna metoda analityczna, wykorzystująca jako fazę stacjonarną cienką warstwę

porowatego sorbentu, oraz ciecz jako fazę ruchomą (eluent). Rozdział chromatograficzny

zachodzi w wyniku przepływu eluentu przez warstwę sorbentu, wciąganego przez sorbent na

skutek działania sił kapilarnych. Metoda TLC, szeroko stosowana jako podstawowa metoda

rozdziału i identyfikacji związków organicznych, jest ceniona ze względu na prostotę i szybkość

oraz niskie koszty.

W chromatografii cienkowarstwowej stosowane są na ogół te same sorbenty, co w kolumnowej

chromatografii cieczowej (najczęściej modyfikowany żel krzemionkowy). Rozdział

chromatograficzny prowadzi się w specjalnej, zamkniętej komorze, zawierającej eluent i

atmosferę nasycona jego parami. Do wizualizacji efektów rozdziału wykorzystywane są

specjalne reagenty, tworzące ze związkami organicznymi barwne związki. Można też posłużyć

się światłem ultrafioletowym, wywołującym fluorescencję sorbentu, maskowaną przez

rozdzielone składniki próbki.

Chromatografia fluidalna / Chromatografia płynem nadkrytycznym (SFC - supercritical fluid

chromatography)

Jest to nowa metoda chromatograficzna, łącząca cechy chromatografii gazowej i cieczowej. Jako

fazę ruchomą wykorzystuje gaz w warunkach nadkrytycznych (np. dwutlenek węgla w temp.

powyżej 31°C i 7 MPa), w których zanikają różnice pomiędzy fazą ciekłą i gazową.

Chromatografia fluidalna jest stosowana m.in. do rozdziału substancji trudno rozpuszczalnych,

gdyż fazy nadkrytyczne wykazują zdolność do rozpuszczania substancji złożonych z dużych,

niepolarnych cząsteczek, np. wyższych alkanów lub węglowodorów poliaromatycznych.

Aparatura SFC przypomina układ do HPLC i zawiera pompę dozującą eluent, zawór służący do

wprowadzania próbek, kolumnę (pakowaną lub kapilarną), regulator ciśnienia oraz detektor

(zwykle znany z chromatografii gazowej detektor płomieniowo-jonizacyjny). Układ może być

wyposażony w programator ciśnienia eluentu, umożliwiający osiągnięcie optymalnych

warunków rozdziału.

Ćwiczenia

1. Reakcje charakterystyczne tłuszczów prostych

a. Wykazanie obecności kwasów nienasyconych w tłuszczach

Zasada:

Pod wpływem KMnO

4

następuje utlenienie nienasyconych kwasów tłuszczowych. W miejscu

podwójnego wiązania zostaje przyłączony tlen i kwas tłuszczowy rozpada się na dwa fragmenty.

Analiza ich pozwala ustalić miejsce położenia nienasyconego wiązania w łańcuchu kwasu

tłuszczowego.

Rys. 9. Wzór strukturalny lipidu właściwego oraz przykłady kwasów tłuszczowych

Wykonanie:

Do probówki zawierającej dwie krople oliwy dodać 5 cm

3

Na

2

CO

3

o stężeniu 1 mol·dm

-3

.

Zawartość probówki lekko ogrzać i wstrząsając, dodawać po kropli KMnO

4

o stężeniu 0,01

mol·dm

-3

aż do wystąpienia trwającego ok. 2 minuty różowego zabarwienia.

b. Wykrywanie glicerolu

Zasada:

Jedną z reakcji służących do wykrywania glicerolu jest zdolność tworzenia w środowisku

zasadowym z jonami miedziowymi kompleksu o zielononiebieskiej barwie (reakcja Wagenaara).

Kompleks chelatowy tworzą dwie cząsteczki glicerolu i jeden atom miedzi. Inny sposób

wykrywania glicerolu polega na odwodnieniu glicerolu. Pod wpływem ogrzewania z KHSO

4

przekształca się on w akroleinę – nienasycony aldehyd o charakterystycznym drażniącym zapachu

(Rys. 10).

Rys. 10. Reakcja odwodnienia glicerolu

Wykonanie:

Do wykrycia glicerolu można wykorzystać następujące reakcje:

a). Umieścić w probówce kroplę glicerolu, dodać 3 cm

3

5% etanolowego roztworu NaOH i 0,5

cm

3

nasyconego roztworu CuSO

4

. W obecności glicerolu powstaje zielononiebieski osad.

b). Do dwóch kropli glicerolu umieszczonych w suchej probówce dodać około 100 mg KHSO

4

.

Zawartość probówki ogrzewać ostrożnie (!) nad płomieniem palnika aż do wystąpienia

charakterystycznego ostrego zapachu.

2. Ekstrakcja i frakcjonowanie lipidów z żółtka jaja kurzego

Wykonanie:

1 łyżeczkę żółtka jaja kurzego zalać 18 cm

3

mieszaniny składającej się z chloroformu i metanolu

zmieszanych w stosunku 1:2 i mieszać starannie przez kilka minut. Następnie mieszaninę wlać do

plastikowych próbówek wirówkowych i odwirować (5 min., 15.000 obr/min). Odessać (pipetą)

ciecz znad osadu, dodać do niej 5 cm

3

wody, dokładnie wymieszać, a następnie odessać górną

warstwę wodną. Chloroformowy ekstrakt lipidowy wlać do cylindra miarowego i uzupełnić

chloroformem do 10 cm

3

i pozostawić do dalszych doświadczeń (punkt a i d)

a. Wytrącanie pochodnych kwasu fosfatydowego

Rys. 11. Wzór strukturalny A. kwasu fosfatydowego i B. lecytyny

A. B.

Wykonanie:

7,5 cm

3

roztworu otrzymanego powyżej przelać powoli do cylindra z 15 cm

3

acetonu. Wytrąca się

osad glicerofosfolipidów, głównie lecytyn. Przelać zawartość do 2 plastikowych próbówek

wirówkowych (po równo) i odwirować (jak wyżej), a następnie przenieść delikatnie do 3 cm

3

wody. Wykryć obecność choliny według procedury opisanej w podpunkcie b i jonów

ortofosforanowych według procedury opisanej w podpunkcie c.

b. Wykrywanie choliny

Wykonanie:

Odmierzyć do probówki 1 cm

3

roztworu otrzymanego w podpunkcie a, dodać 1 cm

3

10% roztworu

KOH i ostrożnie (!) ogrzewać nad małym płomieniem palnika aż do pojawienia się

charakterystycznego zapachu. Zachodząca reakcja została przedstawiona poniżej:

Rys. 12. Schemat reakcji wykrywania choliny

cholina



tlenek etylenu + trójmetyloamina

c. Wykrywanie jonów ortofosforanowych

Zasada:

Obecność fosforanu można wykryć stosując kwaśny roztwór molibdenianu amonowego. Tworzy

się w tych warunkach kompleks soli amonowej heteropolikwasu czterotrójmolibdeniano-

fosforowego o żółtej barwie.

(NH

4

)

2

MoO

4

PO

4

3-

(NH

4

)

3

[P(Mo

3

O

10

)

4

]

Wykonanie:

Odmierzyć do probówki 1 cm

3

roztworu otrzymanego w punkcie a i dodać 0,5 cm

3

20% roztworu

NaOH. Zawartość probówki dobrze wymieszać, wrzucić "porcelankę" i gotować nad palnikiem

przez 2 minuty. Następnie dodać 2 cm

3

odczynnika molibdenianiowego (2% (NH

4

)

2

MoO

4

).

Roztwór barwi się na kolor żółty, co świadczy o obecności fosforanów.

UWAGA: poza żółknięciem roztworu można obserwować także wydzielanie się warstwy kwasów

tłuszczowych na powierzchni cieczy

3. Oznaczanie zawartości tłuszczu w mleku

Wykonanie:

3,5 cm

3

mleka umieścić w plastikowej probówce wirówkowej, a następnie bardzo powoli,

wstrząsając, dodać po kropli 3 cm

3

stężonego kwasu siarkowego. Unikać zagrzania probówki !

Dodać 0,3 cm

3

alkoholu amylowego, zmieszać i umieścić probówkę w wirówce. Wirować przez 5

minut przy 10000 obr./min. Po odwirowaniu zaobserwować wysokość słupa tłuszczu w górnej

części probówki.

4. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) fosfolipidów

Wykonanie:

Skład fosfolipidowy próbki określić metodą chromatografii cienkowarstwowej na płytkach

Kieselgel 60 (0,25 mm) firmy Merck. Przed nałożeniem próbek płytki należy aktywować w 110°C

przez 30 minut.

Komorę chromatograficzną (Rys. 13) napełnić 60 cm

3

mieszaniny rozwijającej (chloroform :

metanol : kwas octowy zmieszane w stosunku 65:25:8; v/v/v) i pozostawić zamkniętą przez 30

minut dla zrównoważenia (osiągnięcia stanu równowagi pomiędzy parami a mieszaniną).

Rys. 13. Komora chromatograficzna

Otrzymywanie ekstraktu lipidowego:

Jeden gram zlofilizowanego materiału roślinnego zmieszać z 10 cm

3

mieszaniny chloroformu i

metanolu 1:2 v:v. Odwirować 10 000 obr./min. Do analizy pobrać nasącz (ekstrakt).

Za pomocą mikropipety automatycznej nanieść na płytkę po 5



l chloroformowego ekstraktu

lipidów oraz standardy lipidowe firmy Sigma. Poszczególne roztwory winny być nakładane w

formie 5 mm paska (odstęp pomiędzy próbkami 1,5 cm; odstęp od dolnej krawędzi 1,5 cm; odstęp

od krawędzi bocznych 1,7 cm), przed zmianą nakładanego roztworu należy bezwzględnie

zmieniać końcówki pipety. Płytkę umieścić w komorze chromatograficznej zanurzając płytkę na

głębokość 5 cm w mieszaninie rozwijającej. Po rozwinięciu chromatogramu (po około 40-50

minut) płytki wysuszyć na powietrzu, wysuszone płytki umieścić w komorze wypełnionej parami

jodu i po uwidocznieniu się plamek obrysować je ołówkiem.

5. Wyznaczanie liczby kwasowej

Zasada:

Liczba kwasowa charakteryzuje ilość wolnych (niezobojętnionych) reszt kwasów organicznych

zawartych w tłuszczu. Określa się ją liczbą mg KOH potrzebnych do zobojętnienia wolnych reszt

kwasowych zawartych w 1 g tłuszczu. Podwyższona wartość liczby kwasowej może świadczyć o

procesach hydrolizy (jełczenia) tłuszczu, np. przy zbyt długim przechowywaniu.

Wykonanie:

Do kolbek odważyć po 5 g świeżego i starego tłuszczu. Każdą z próbek rozpuścić dokładnie w 50

cm

3

rozpuszczalnika benzynowego (ewentualnie OSTROŻNIE!!! podgrzewając). Po ostudzeniu

zmiareczkować próbkę 0,1 M etanolowym roztworem KOH w obecności fenoloftaleiny do

uzyskania trwałej, różowej barwy. Powtórzyć miareczkowanie w czystym rozpuszczalniku. (Ilość

KOH, którą zużyto do miareczkowania czystego rozpuszczalnika należy odjąć od ilości zasady

zużytej do miareczkowania tłuszczu). Obliczyć ilość KOH zużytą na zobojętnienie samego

tłuszczu, następnie wyznaczyć liczbę mg KOH potrzebną do zobojętnienia 1 g tłuszczu. W

obliczeniach przyjąć masę cząsteczkową KOH równą 56,11.

Przykładowe obliczenia:

Jeżeli na zobojętnienie 5g tłuszczu zużyto 20 cm

3

0,1 M (0,1 mola w 1000 cm

3

) KOH, to

wyliczamy, że w 20 cm

3

znajdowało się 50 razy mniej moli KOH czyli 2 milimole. 1 mol KOH

waży 56,11 g, a 2 milimole 112 mg. Na zobojętnienie 5 g tłuszczu zużyto zatem 112 mg KOH,

czyli na 1 g tłuszczu potrzeba 2,24 mg tej zasady.

6. Wyznaczanie liczby zmydlania

Zasada:

Liczba zmydlania charakteryzuje całkowitą ilość zestryfikowanych oraz wolnych

(niezobojętnionych) reszt kwasów organicznych zawartych w tłuszczu. Określa się ją liczbą mg

KOH potrzebnych do zobojętnienia wszystkich reszt kwasowych zawartych w 1 g tłuszczu. Liczba

ta pozwala wyznaczyć średnią masę cząsteczkową kwasów tłuszczowych zawartych w tłuszczu

(długość łańcucha węglowodorowego).

Wykonanie:

Do kolbek odważyć po 1 g tłuszczu stałego i tłuszczu płynnego, a następnie dodać 10 cm

3

0,5 M

roztworu KOH i 50 cm

3

etanolu, po czym ogrzewać przez 20 min na wrzącej łaźni wodnej i pod

chłodnicą zwrotną, albo nakrywając wylot kolby (lub lepiej zlewki) okrągłodenną kolbą, napełnioną

w połowie zimną wodą w celu skraplania oparów etanolu. Następuje wówczas hydroliza tłuszczu.

Po ostudzeniu zmiareczkować nadmiar niezobojętnionego KOH 0,5 M roztworem HCl wobec

fenoloftaleiny do zaniknięcia różowej barwy. Równolegle wykonać próbę kontrolną bez tłuszczu

(powtórzyć pomiar w czystym rozpuszczalniku).

7. Zmydlanie tłuszczów, wytwarzanie mydła, wytrącanie mydła

Zasada:

Tłuszcze jako estry kwasów tłuszczowych i glicerolu są podatne na hydrolizę. Jeśli hydrolizę

prowadzi się za pomocą wodorotlenku sodowego wówczas wydziela się wolny glicerol i sodowa

sól kwasu tłuszczowego, czyli mydło. Mydła sodowe i potasowe są rozpuszczalne, natomiast mydła

magnezowe, wapniowe i innych metali są nierozpuszczalne w wodzie.

Z roztworu wodnego można wydzielić mydło przez wysalanie w nasyconym roztworze NaCl albo

przez dodanie roztworu dowolnej soli, która wytwarza nierozpuszczalne mydło.

Rys. 14. Reakcja zmydlania tłuszczu

Wykonanie:

a) Do zlewki odważyć ok. 5 g tłuszczu, a następnie dodać 8 cm

3

30% NaOH i 5 cm

3

etanolu.

Podgrzewać łagodnie przez kilka minut, stale mieszając, aż utworzy się jednolita masa. Wówczas

dodać ok. 200 cm

3

gorącej destylowanej wody i dalej podgrzewać aż do rozpuszczenia mydła.

b) Do 20 cm

3

otrzymanego powyżej roztworu mydła dodać stopniowo stały chlorek sodowy aż do

uzyskania stanu wysycenia. Z roztworu wytrąca się wówczas osad mydła sodowego

nierozpuszczalnego w tym roztworze, które można wydzielić przez dekantację, wirowanie albo

sączenie.

c) Do 4 probówek wlać po 2 cm

3

roztworu mydła otrzymanego w podpunkcie a), dodać po 1 cm

3

rozcieńczonych roztworów Ca(NO

3

)

2

lub CaCl

2

, BaCl

2

, CuSO

4

i Pb(CH

3

COO)

2

. W każdym

przypadku wytrącają się osady mydeł nierozpuszczalnych pomimo dodawania większej objętości

wody.

8. Wyznaczanie liczby jodowej

Zasada:

Liczba jodowa charakteryzuje ilość podwójnych wiązań w kwasach tłuszczowych (stopień ich

nienasycenia). Określa się ją liczbą gramów jodu przyłączonych przez nienasycone kwasy

tłuszczowe zawarte w 100 g tłuszczu. Tłuszcz rozpuszcza się w rozpuszczalniku i dodaje bromek

jodu JBr, który przyłącza się do podwójnego wiązania w tłuszczu.

Rys. 15. Wzory przykładowych kwasów tłuszczowych nienasyconych oraz przyłączanie się jodu i

bromu do podwójnego wiązania

Nadmiar JBr reaguje z jodkiem potasu tworząc bromek potasu i uwalniając jod cząsteczkowy (J

2

).

JBr + KJ = J

2

+ KBr

Ostatecznie wydzielony jod miareczkuje się tiosiarczanem sodu Na

2

S

2

O

3

w obecności skrobi jako

wskaźnika:

J

2

+ 2Na

2

S

2

O

3

= Na

2

S

4

O

6

+ 2NaJ

Płynne tłuszcze zawierające nienasycone kwasy tłuszczowe charakteryzują się wysokimi

wartościami liczby jodowej.

Wykonanie:

Do dwóch kolbek ze szlifem o pojemności 200-300 cm

3

odważyć po 0,5 g tłuszczu płynnego i

stałego, a następnie rozpuścić w 10 cm

3

chloroformu. Następnie dodać 15 cm

3

odczynnika Hanusa

(1g JBr rozpuszczony w 50 cm

3

lodowatego kwasu octowego), wymieszać, zamknąć starannie i

odstawić na 30 min w ciemne miejsce. Po tym czasie dodać 50 cm

3

3% wodnego roztworu KJ,

spłukując starannie szyjkę i korek. Wymieszać i miareczkować 0,1 M roztworem Na

2

S

2

O

3

w

obecności skrobi jako wskaźnika (dodać kroplę kleiku skrobiowego) do zaniku niebieskiej (czasem

czarnej) barwy. Równolegle wykonać analizę kontrolną w ślepej próbie nie zawierającej tłuszczu.

Różnica objętości tiosiarczanu zużytego w ślepej próbie i próbie pomiarowej pozwala wyliczyć

ilość jodu wydzieloną w reakcji badanej próbki tłuszczu. Porównać wartości liczby jodowej dla

obydwu badanych tłuszczów, zinterpretować wyliczoną różnicę.

Jak wynika z powyższego równania 1 mol cząsteczkowego jodu reaguje z 2 molami tiosiarczanu

sodu. 1 cm

3

roztworu 0,1 M tiosiarczanu sodu zużytego w miareczkowaniu zawiera 0,1 mM

tiosiarczanu, który proporcjonalnie reaguje z 0,05 mM jodu, czyli z 22 mg J

2

. Należy zatem

przeliczyć, ile milimoli tiosiarczanu zużyto na zmiareczkowanie wolnego jodu i z proporcji

obliczyć liczbę miligramów jodu. Im mniej jest wiązań podwójnych w badanym tłuszczu, tym

mniej bromku jodku jest wiązane, a więc więcej wolnego jodu wydziela się w reakcji z jodkiem

potasu. A zatem więcej tiosiarczanu sodu zużywa się podczas miareczkowania. Duża liczba jodowa

świadczy o wysokim stopniu nasycenia kwasów w badanym tłuszczu (czyli o małej liczbie wiązań

podwójnych).