AMINOKWASY

1. Analiza jakościowa aminokwasów

Na podstawie reakcji a, b, c rozróżnić następujące związki: prolinę, metioninę, cysteinę,

tyrozynę, kwas bursztynowy

a. Odróżnianie aminokwasów od innych związków

Wykonanie:

Odmierzyć do 5 probówek po 0,5 cm

3

roztworów oznaczonych jako A, B, C, D, E. Do wszystkich

probówek dodać po 0,5 cm

3

0.1% roztworu ninhydryny w acetonie i ogrzewać przez trzy minuty

na łaźni wodnej. Pojawia się intensywne zabarwienie fioletowe w obecności wolnego aminokwasu

lub żółte w obecności wolnego iminokwasu. Reakcja ta może być używana do ilościowego

oznaczania wolnych aminokwasów, a reakcja z tzw. kwaśną ninhydryną (roztwór ninhydryny w

mieszaninie kwasu octowego i fosforowego) do ilościowego oznaczania wolnej proliny.

Rys. 16. Wzory strukturalne A. izoleucyny i B. proliny (iminokwasu)

A B

b. Wykrywanie wolnych grup tiolowych

Zasada:

Do aminokwasów zawierających atomy siarki należy metionina, cysteina i cystyna (Rys. 17). W

celu wykrycia obecności grupy tiolowej należy do eksperymentu wziąć cysteinę lub cystynę,

bowiem metionina ma atom siarki związany z grupą metylową.

Rys. 17. Wzory strukturalne A. metioniny, B. cysteiny i C. cystyny.

A B C

Wykonanie:

Odmierzyć do probówek po 0,5 cm

3

roztworów niezidentyfikowanych w punkcie a. Do każdej

próby dodać po 1 cm

3

20% roztworu NaOH oraz po 0,25 cm

3

2% roztworu octanu ołowiowego.

Ogrzewać przez 3 do 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. W obecności grup tiolowych tworzy się

brunatnoczarny osad.

c. Wykrywanie obecności pierścieni aromatycznych

Zasada:

Do aminokwasów zawierających pierścień aromatyczny zaliczane są: tryptofan, tyrozyna i

fenyloalanina (Rys. 18). Ten ostatni aminokwas jest na tyle niestabilny, że w poniżej

przedstawionej reakcji w roztworze wodnym pierścień aromatyczny ulega rozerwaniu. Obecność

grup -OH przy pierścieniu zwiększa natomiast jego trwałość. Z tego względu eksperyment lepiej

wykonać na tyrozynie i tryptofanie.

Rys. 18. Wzory strukturalne aminokwasów aromatycznych

Wykonanie:

Odmierzyć do probówek po 0,5 cm

3

roztworów niewyeliminowanych w podpunktach a i b. Do

każdej próby dodać po 0,5 cm

3

stężonego kwasu azotowego i ogrzewać przez 5 minut we wrzącej

łaźni wodnej. Po ostudzeniu dodać ostrożnie (!), małymi porcjami, i ciągle mieszając po 1,75 cm

3

20% roztworu NaOH. W obecności pierścieni aromatycznych pojawia się pomarańczowe

zabarwienie.

Sprawozdanie:

Podać jakie związki były oznaczone literami A, B, C, D, E i na jakiej podstawie poszczególne

aminokwasy zostały rozróżnione.

2. Oznaczanie ilościowe aminokwasów metodą formaldehydową Sorensena

Zasada:

Formaldehyd (HCOH) kondensuje z grupą aminową aminokwasów wydzielając wodę i tworząc

grupę -N=CH

2

. Tym samym aminokwasy tracą właściwości amfoteryczne i można je

miareczkować wodorotlenkiem sodowym w obecności fenoloftaleiny.

COOH

COOH

|

|

H-C-NH

2

+ HCOH = H-C-N=CH

2

+ H

2

O

|

|

R

R

Wykonanie:

Pobrać 10 cm

3

roztworu glicyny do kolby stożkowej, dodać 20 cm

3

20% formaliny (pod wyciągiem) i

zmiareczkować 0,1 mol/dm

3

roztworem NaOH wobec fenoloftaleiny. Oddzielnie w ten sam sposób

wykonać miareczkowanie ślepej próby (do formaliny dodać wodę destylowana zamiast roztworu

aminokwasu zachowując proporcje objętościowe oraz dwie krople fenoloftaleiny). Z różnicy ilości

zużytego NaOH wyliczyć ilość moli aminokwasu w próbce. Wynik podać w mg/cm

3

. Biorąc pod

uwagę, że 1 mol NaOH reaguje z 1 molem aminokwasu można wyliczyć, że 1 cm

3

0,1 M roztworu

NaOH odpowiada 100 mikromolom aminokwasu.

3. Miareczkowanie aminokwasu

Wykonanie:

Do zlewki o pojemności 50 cm

3

nalać 20 cm

3

roztworu trzech różnych aminokwasów, np.

alaniny, kwasu glutaminowego i lizyny o stężeniu 1 mol



dm

-3

. Zlewkę ustawić na mieszadle

magnetycznym, wrzucić do środka „element mieszający”, uruchomić mieszadło i umieścić w

zlewce elektrodę pH-metru w sposób uniemożliwiający jej rozbicie. Zapisać wartość pH.

Dodawać stopniowo (po 0,5 cm

3

) 10 cm

3

1 molowego roztworu HCl. Każdorazowo, po

ustabilizowaniu się odczytu pH zapisywać jego wartość. Powtórzyć procedurę używając do

miareczkowania roztworu NaOH o stężeniu 1 mol



dm

-3

.

Rys. 19. Przykładowa krzywa miareczkowania glicyny

Sprawozdanie:

Na podstawie obydwu wyników narysować krzywą miareczkowania: na osi x wartości pH, na

osi y ilość dodanego HCl (wartości dodatnie) i NaOH (wartości ujemne). Odczytać z wykresu

wartość punktu izoelektrycznego (odczyt pH przed miareczkowaniem), oraz pK

a

i pK

b

(punkty

przegięcia krzywej). Narysować na wykresie w jakich formach jonowych występuje dany

aminokwas na poszczególnych odcinkach krzywej, oraz wyjaśnić jej charakterystyczny przebieg.

4. Chromatografia bibułowa aminokwasów

Zasada:

Informacje na temat metod chromatograficznych podano na str…..

Wykonanie:

Przygotować cztery szalki Petri’ego. Do dolnej części każdej z szalek wlać rozpuszczalnik

(mieszaninę trzeciorzędowego butanolu, 88% kwasu mrówkowego i wody w stosunku

objętościowym 15:15:70). Z bibuły wyciąć 4 krążki o średnicy trochę większej niż szalka. W

każdym krążku naciąć pasek o szerokości 5 mm dochodzący do środka krążka i zagiąć tak, by

tylko on sięgał do rozpuszczalnika w szalce, a reszta krążka była w powietrzu. W odległości 2

mm od środka krążka zakreślić ołówkiem na naciętym pasku kółeczko o średnicy 1,5 mm (Rys.

20 b). Na narysowaną kroplę nakładać powoli 1% roztwory: glicyny, fenyloalaniny, seryny i

badanego aminokwasu (na jeden krążek po jednym aminokwasie). Nanoszenie przeprowadzamy

stopniowo (tak by mokra plama nie wyszła poza zaznaczone pole) za pomocą pipety o

pojemności 0,2 do 10



l. Po dodaniu każdej kolejnej kropli bibułę należy przesuszyć. Łącznie

należy nanieść 20



l aminokwasu.

Rys. 20. Schemat chromatografii bibułowej aminokwasu

a) widok ogólny

b) nakładanie aminokwasu c) sposób odczytu R

f

Krążek bibuły umieścić między dwoma częściami szalki, tak, aby koniec zgiętego paska

zanurzył się w rozpuszczalniku, a brzegi wystawały poza szalkę (Rys. 20 a). Tym paskiem

rozpuszczalnik będzie podsiąkał i stopniowo rozprowadzał aminokwas ku brzegom krążka. Po

około godzinie, gdy czoło rozpuszczalnika zbliży się do brzegu bibuły, wyjąć chromatogram i

zaznaczyć ołówkiem front rozpuszczalnika. Całość wysuszyć w 110



C i spryskać 0,1%

roztworem ninhydryny w 95% etanolu. Wysuszyć ponownie w 110



C i obrysować ołówkiem

barwny krążek. Obliczyć współczynnik migracji R

f

dla każdego wzorcowego i badanego

aminokwasu według wzoru:

B

A

R

f



(Rys. 20 c). Zidentyfikować nieznany aminokwas

porównując wartości R

f

nieznanego aminokwasu z R

f

wzorców.

5. Oznaczanie zawartości proliny

Zasada:

Prolina jest aminokwasem syntetyzowanym często w reakcji obronnej rośliny na stresy

powodujące odwodnienie cytoplazmy, przykładowo w czasie suszy czy w trakcie wzrostu

rośliny w zasolonym podłożu. Główną rolą proliny jest obniżenie potencjału osmotycznego

komórki dla wyrównania stężeń jonów pomiędzy wakuolą, gdzie są akumulowane sole, a

cytoplazmą. Ponadto, prolina chroni strukturę białek i błon cytoplazmatycznych przed ujemnymi

skutkami zbyt dużego stężenia jonów soli.

Wykonanie:

Ilościową analizę zawartości wolnej proliny wykonuje się najczęściej metodą kolorymetryczną

(Bates i in. 1973). Tkankę roślinną o masie 250 mg homogenizować w 3% kwasie

sulfosalicylowym, a następnie odwirować przy 14 000 obr./min. Do 2 cm

3

supernatantu dodać 2

cm

3

lodowatego kwasu octowego i 2 cm

3

kwaśnej ninhydryny (1,25 g ninhydryny rozpuścić w

30 cm

3

lodowatego kwasu octowego i 20 cm

3

6 M kwasu ortofosforowego). Całość zmieszać na

wstrząsarce, a następnie inkubować przez 1 godzinę w 100ºC. Po zatrzymaniu reakcji w lodzie

do próbek dodać 4 cm

3

toluenu i ponownie wytrząsać. Toluen zawierający barwnik odessać

znad fazy wodnej i po osiągnięciu temperatury pokojowej zmierzyć jego absorbancję przy



=520 nm względem ślepej próby, którą stanowił toluen. Stężenie aminokwasu obliczyć na

podstawie równania regresji liniowej dopasowanego do punktów krzywej kalibracyjnej

wykonanej dla roztworów proliny w 3% kwasie sulfosalicylowym o stężeniu: 3,62; 7,25; 12,5;

25 i 100 μg/cm

3

.

Piśmiennictwo:

Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D., 1973. Rapid determination of free proline for water stress

studies. Plant and Soil 39: 205-207.

BIAŁKA

Najczęściej stosowane metody oznaczania białek

Elektroforeza SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis),

Elektroforeza to przemieszczanie się obdarzonych ładunkiem cząstek (jonów) w polu

elektrycznym, np. cząsteczek białek lub kwasów nukleinowych. Większość metod

elektroforetycznych wykorzystuje specyficzne nośniki, tj. żele poliakrylamidowe lub agarozowe,

lub bibułę. Przemieszczanie się jonów w polu elektrycznym zależy od ich ładunku, wielkości i

kształtu. Im większy jon lub bardziej rozbudowany jego kształt, tym wolniej porusza się w polu

elektrycznym, a im bardziej naładowany – tym porusza się szybciej. Jony naładowane ujemnie

migrują do anody, a naładowane dodatnio – do katody. W przypadku cząstek zawierających w

swym składzie ugrupowania naładowane dodatnio i ujemnie (np. białka), o kierunku migracji

decyduje ich ładunek wypadkowy.

Białka najczęściej rozdzielamy metodą elektroforezy w żelach poliakryloamidowych w

obecności SDS (dodecylosiarczan sodu), w której ich rozdział jest zależny tylko od ich

wielkości. SDS jest detergentem anionowym denaturującym i „spłaszczającym” białko, w

wyniku czego łańcuch polipeptydowy a) traci struktury wyższego rzędu, b) staje się anionem.

Dodatkowo, przeprowadza się redukcję wiązań dwusiarczkowych białka i w wyniku tego jego

poszczególne łańcuchy polipeptydowe funkcjonują w roztworze niezależnie od siebie. W

efekcie, wszystkie białka (łańcuchy polipeptydowe) mają taki sam liniowy kształt oraz ładunek

ujemny, a szybkość ich migracji w żelu zależy wyłącznie od ich wielkości. Białka na ogół są

bezbarwne, w związku z tym po przeprowadzonym rozdziale żel trzeba zabarwić, aby

uwidocznić obecne w nim białka. W tym celu najczęściej stosuje się barwienie błękitem

kumasyny lub związkami srebra.

SDS-PAGE wykorzystuje się także do wyznaczania masy cząsteczkowej analizowanego białka

(przez porównanie z wielkością białek wzorcowych) oraz do określania liczby jego podjednostek

polipeptydowych.

Rys. 21. Zestaw do elektroforezy żelowej

Rys. 22. Schemat nanoszenia próbek do studzienek zawierających żel oraz zasada rozdziału

białek

Rys. 23. Przykładowy żel poliakrylamidowy ujawniający obecność enzymu SOD (białe prążki).

Elektroforeza kapilarna (CE - capillary electrophoresis)

Elektroforeza kapilarna to nowa metoda analityczna, wykorzystująca efekt elektroforezy do

separacji jonów oraz naładowanych makrocząsteczek i agregatów cząsteczek, zachodzący w

cienkiej kapilarze kwarcowej. Pomimo odmiennego mechanizmu rozdziału, wykazuje ona wiele

podobieństw do metod chromatograficznych. Istnieją różne typy sorbentów, przeznaczonych do

oczyszczania wielu różnych rodzajów próbek. Rurki zawierające sorbenty SPE przypominają

plastikowe strzykawki. Specjalne akcesoria umożliwiają jednoczesną pracę z kilkunastoma

próbkami. Metoda SPE jest prosta, szybka i tania, nie wymaga zaawansowanych umiejętności

ani stosowania skomplikowanej aparatury. W porównaniu z innymi metodami znacznie

ogranicza zużycie rozpuszczalników.

Rys. 24. Przykładowy aparat do elektroforezy kapilarnej

Rys. 25. Zasada wykrywania białek przy użyciu elektroforezy kapilarnej

Ćwiczenia

1. Wykrywanie wiązań peptydowych (reakcja biuretowa - Piotrowskiego)

Zasada:

Reakcja biuretowa polega na tworzeniu kompleksu miedzi z atomami tlenu i azotu z wiązań

peptydowych -CO-NH- o charakterystycznej fioletowej barwie. Warunkiem koniecznym

zachodzenia reakcji jest by w cząsteczce związku występowały przynajmniej dwa takie wiązania.

Stąd nazwa reakcji „biuretowa", ponieważ najprostszym związkiem spełniającym ten warunek jest

dwumocznik, czyli biuret NH

2

-CO-NH-CO-NH

2

(produkt powstały w wyniku ogrzania mocznika).

W białkach występuje wiele wiązań peptydowych, których enolowe formy tautomeryczne HO-

C=N- dają reakcję biuretową. Kompleks z jonem miedzi tworzą dwa atomy tlenu (wiązania atomo-

we) i cztery atomy azotu (wiązania koordynacyjne).

Wykonanie:

Do trzech probówek wlać po 2 cm

3

roztworu białka z jaja kurzego, kazeiny i glicyny (do każdej

probówki po jednym roztworze), a następnie do każdej z nich dodać po 2 cm

3

10% NaOH i parę

kropel 0,5% CuSO

4

. W obecności wiązań peptydowych pojawia się fioletowa barwa.

Uwaga! nie stosować zbyt dużej objętości CuSO

4

, ponieważ jego niebieska barwa może maskować

pozytywny wynik reakcji biuretowej.

2. Miareczkowanie białka

Zasada:

Krzywa zmian pH podczas miareczkowania mocnego kwasu mocną zasadą ma charakterystyczny,

esowaty kształt z bardzo stromym przebiegiem przy pH około 7. Miareczkowanie aminokwasu daje

przebieg z dwoma skokami pH przy zobojętnianiu grup aminowych i karboksylowych. W

przypadku miareczkowania białka składającego się z różnych aminokwasów krzywa

miareczkowania ma przebieg łagodny, pozwalający wyznaczyć ich pojemność buforową (ilość

kwasu lub zasady powodującą określoną zmianę pH). Własności buforujące białek w komórkach

łagodzą zmiany pH spowodowane np. wymianą jonową, tworzeniem i rozkładem różnych kwasów,

spożyciem kwaśnych pokarmów, zmianą równowagi pomiędzy jonami węglanowymi i

wodorowęglanowymi itp.

Wykonanie:

Do 2 zlewek o pojemności 100 cm

3

wlać po 40 cm

3

wody, a do dwóch następnych po 40 cm

3

1%

kazeiny. Zlewki ustawić na mieszadle magnetycznym, wrzucić do środka „myszkę” (element

mieszający), uruchomić mieszadło i umieścić w zlewce elektrodę pH-metru w sposób

uniemożliwiający jej rozbicie. Zapisać wartość pH. Następnie jedną parę roztworów (woda,

białko) miareczkować 0,5 M HCl (do osiągnięcia pH < 4), a drugą parę miareczkować 0,5 M NaOH

(do pH > 10). Kwas solny i wodorotlenek sodu dodawać porcjami (po 1 cm

3

za pomocą pipety

automatycznej). Każdorazowo, po ustabilizowaniu się odczytu pH zapisywać jego wartość.

Sprawozdanie

Narysować krzywą miareczkowania: na osi x wartości pH, na osi y ilość dodanego HCl

(wartości dodatnie) i NaOH (wartości ujemne). Odczytać z wykresu wartość punktu

izoelektrycznego (odczyt pH przed miareczkowaniem), oraz pK

a

i pK

b

(punkty przegięcia

krzywej) oraz wyjaśnić jej charakterystyczny przebieg.

3. Właściwości ochronne koloidów hydrofilnych

Zasada:

Białka są cząsteczkami wykazującymi ładunek dodatni lub ujemny, w zależności od przewagi

budujących je aminokwasów kwaśnych lub zasadowych. Białka mają zatem wybitnie charakter

hydrofilny i są w roztworach otoczone dipolami wody, tworzącymi tzw. otoczkę wodną wokół

każdej cząsteczki. Koloidy hydrofilne, same trwałe w środowisku wodnym i nie ulegające

samorzutnej koagulacji, mogą osadzać się na powierzchni innych nietrwałych koloidów, i

wówczas oddziałują jako czynnik zwiększający ich trwałość, wytwarzając na ich powierzchni

wspólną otoczkę wodną. W ten sposób białka np. spowolniają proces łączenia się micelli

tłuszczu, bądź też nie dopuszczają do reakcji poszczególnych jonów ze sobą.

Rys. 26. Cząsteczka białka z otoczką wodną

Wykonanie:

Do 2 probówek wlać po 2 cm

3

0,01 mol·dm

-3

roztworu AgNO

3

i kilka kropel rozcieńczonego

HNO

3

. Następnie do pierwszej probówki dodać 2 cm

3

0,5-proc. roztworu albuminy lub białka z

jaja kurzego, a do drugiej 2 cm

3

wody. Po zmieszaniu do obydwu probówek wlać kroplami 4

cm

3

0,01 mol·dm

-3

NaCl. W probówce z białkiem nie wytrąca się charakterystyczny osad AgCl.

4. Wysalanie białek

Zasada:

Białka ulegają wysoleniu z roztworu wodnego pod wpływem wysokiego stężenia soli, takich jak

MgSO

4

, NaCl, Na

2

SO

4

oraz przede wszystkim (NH

4

)

2

SO

4

. Mechanizm procesu polega na

konkurencji o wodę i w konsekwencji – na niszczeniu otoczki wodnej miceli białkowych. Proces

ten jest odwracalny, tzn. osad białkowy rozpuszcza się ponownie po zmniejszeniu stężenia soli.

Białka z grupy globulin wysalają się już przy 50% nasycenia siarczanem amonowym, podczas

gdy albuminy tracą trudniej otoczkę wodną i wysalają się dopiero przy całkowitym wysyceniu

roztworu siarczanem amonowym. Ta właściwość globulin i albumin pozwala rozdzielić te grupy

białek podczas stopniowego zwiększania stężenia siarczanu amonowego. Stosowana jest też

często do oczyszczania innych białek, gdyż poszczególne białka ulegają wytrącaniu przy

właściwym im stopniu wysycenia roztworu siarczanu amonowego.

Wykonanie:

Do 100 cm

3

kolby stożkowej wlać 20 cm

3

roztworu białka jaja kurzego i następnie równą

objętość nasyconego roztworu (NH

4

)

2

SO

4

. Wymieszać i odstawić na kilka minut dla wytrącenia

osadu globulin. Osad oddzielić poprzez filtrowanie lub wirowanie. Następnie do roztworu dosy-

pywać małymi porcjami krystaliczny siarczan amonowy mieszając roztwór intensywnie. Kiedy

pierwsza porcja soli nie rozpuści się, przerwać proces i odstawić roztwór na kilka minut. W tych

warunkach wytrącają się albuminy. Osad oddzielić poprzez filtrowanie lub wirowanie. Obydwa

osady białkowe rozpuścić w wodzie.

5. Wyznaczanie wartości punktu izoelektrycznego białka

Zasada:

Wiele właściwości białek jest związanych z ich strukturą pierwszorzędową, wynikającą z sekwencji

(kolejności) aminokwasów, między którymi powstają wiązania peptydowe. Większość aminokwasów

posiada jedną grupę aminową (o charakterze zasadowym) i jedną grupę karboksylową (o charakterze

kwasowym). Grupy te łącząc się ze sobą tworzą wiązania peptydowe i w związku z tym tracą

dotychczasowe właściwości. W powstających łańcuchach polipeptydowych zbudowanych z reszt

aminokwasowych takiego typu występowałaby tylko jedna wolna grupa aminowa na N-końcu i jedna

grupa karboksylowa na C-końcu łańcucha peptydowego. Ponieważ w skład cząsteczek białek wchodzą

również reszty aminokwasów jednoamino-dwukarboksylowych (kwas asparaginowy, kwas

glutaminowy) oraz (diamino?) dwuamino-jednokarboksylowych (lizyna, arginina, histydyna), w białku

pozostaje pewna liczba wolnych grup aminowych i karboksylowych. Gdy więcej jest wolnych grup kar-

boksylowych niż aminowych, wówczas cząsteczki dysocjując w środowisku o odczynie obojętnym

wykazują właściwości kwasów: w obrębie cząsteczek występuje w takich warunkach więcej ładunków

ujemnych niż dodatnich. W cząsteczkach białek zasadowych natomiast, znajdujących się w środowisku o

odczynie obojętnym, występuje więcej ładunków dodatnich niż ujemnych. Przewaga ładunków

jednoimiennych (dodatnich lub ujemnych) sprzyja wiązaniu wody przez cząsteczki białka na zasadzie

oddziaływania elektrostatycznego na dipole wody. Prowadzi to do tworzenia się otoczek wodnych wokół

cząsteczek białka. Roztwór koloidowy białka jest wówczas trwały, gdyż poszczególne cząsteczki nie

łączą się w agregaty, które mogłyby tworzyć zawiesinę wytrącającą się z roztworu (koagulacja).

Zwiększanie stężenia jonów wodorowych (pH maleje) w środowisku powoduje cofanie dysocjacji grup

karboksylowych i ułatwianie dysocjacji grup aminowych, a obniżenie stężenia H

+

(pH rośnie) wywołuje

efekt odwrotny. Dla każdego białka można dobrać taki odczyn środowiska, przy którym jest ono w

jednakowym stopniu zdysocjowane jako kwas i jako zasada. Wartość takiego odczynu (w jednostkach

pH) jest określana mianem punktu izoelektrycznego. Dla białek kwaśnych wartości punktu

izoelektrycznego są niższe od 7, a dla białek zasadowych wyższe. W punkcie izoelektrycznym liczby

ładunków ujemnych i dodatnich w obrębie cząsteczek białka są jednakowe, wskutek czego wypadkowy

ładunek jest równy zero. Z tego powodu zanika oddziaływanie elektrostatyczne cząsteczek białka na

cząsteczki wody. Cząsteczki białka w takich warunkach z łatwością tracą otoczki wodne, co sprzyja ko-

agulacji. Białka w punkcie izoelektrycznym wykazują zatem zmniejszone powinowactwo do wody i

dlatego odczyn środowiska może również wpływać na pęcznienie koloidów białkowych. W układach

biologicznych skutki tego oddziaływania zazwyczaj nie są wyraźnie widoczne w związku z dużą różno-

rodnością białek posiadających różne wartości punktu izoelektrycznego.

Wykonanie:

Do 8 probówek odmierzyć wodę destylowaną i kwas octowy o stężeniu w ilościach podanych w

tabeli 2, zmierzyć pH w probówkach i zanotować w tabeli. Następnie dodać po 1 cm

3

roztworu

kazeiny rozpuszczonej w octanie sodowym. Zawartość probówek wymieszać i po około 5 minutach

ocenić stopień zmętnienia płynów w poszczególnych probówkach.

Substancje

[cm

3

]

Nr probówki

1

2

3

4

5

6

7

8

woda destylowana

8,9 8,8 8,5 8,0

7,0

5,0

1,0

0,0

kwas octowy 0,05 mol dm

-3

0,1 0,2 0,5 1,0

2,0

4,0

8,0

9,0

roztwór kazeiny w octanie

sodowym

1,0 1,0 1,0 1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

pH roztworu

stopień zmętnienia

5. Spektrofotometryczne oznaczanie zawartości białka w materiale roślinnym

Wykonanie:

Pobrać 1 g świeżej masy liścia badanej rośliny i utrzeć w moździerzu w ciekłym azocie. Po

odparowaniu azotu, podczas ucierania, dodawać stopniowo 3 cm

3

buforu ekstrahującego Tris-

HCl (0,0625 mol



dm

-3

, pH 6,8). Homogenat przenieść do probówki wirówkowej, moździerz

przepłukać kolejnymi 3 cm

3

buforu, które należy dodać do homogenatu. Następnie próbki

odwirować przez 10 minut przy 13 000 obr./min.

Sporządzanie krzywej kalibracyjnej

Przygotować wyjściowy roztwór BSA (albuminy wołowej) o stężeniu 10 mg



cm

-3

w buforze

ekstrahującym (rozpuścić 100 mg BSA w 10 cm

3

wody destylowanej). Do probówki pobrać 2

cm

3

roztworu wyjściowego i dopełnić 8 cm

3

wody destylowanej uzyskując w ten sposób stężenie

2 mg w 1 cm

3

. Z roztworu tego pobrać 5 cm

3

do następnej probówki i dopełnić 5 cm

3

wody

uzyskując roztwór o stężeniu 1 mg białka w 1 cm

3

. W ten sposób, metodą kolejnych rozcieńczeń

przygotować roztwory zawierające dalsze stężenia tj. 0,5; 0,25 i 0,125 mg BSA w 1 cm

3

.

Przygotować odczynnik Bradford: 60 mg odczynnika Coomassie Brilliant Blue G-250 rozpuścić

w 1 litrze 3% kwasu nadchlorowego i przefiltrować przez bibułę filtracyjną. Absorbancja

uzyskanego roztworu powinna mieścić się w przedziale 1,3-1,5 przy długości fali 465 nm.

Do każdej z kuwetek spektrofotometrycznych o objętości 3 cm

3

dodać po 0,5 cm

3

wody

destylowanej, 0,5 cm

3

odczynnika Bradford oraz 0,18 cm

3

buforu ekstrakcyjnego (Tris-HCl) a

następnie po 0,02 cm

3

z każdego z roztworów wzorcowych oraz z supernatantu uzyskanego po

odwirowaniu próbek roślinnych. Po zmieszaniu na wstrząsarce laboratoryjnej kuwety odstawić

na 5 minut, po czym zmierzyć wartość absorbancji przy



= 595 nm względem ślepej próby

sporządzonej z 200



l buforu i 1 cm

3

odczynnika Bradford.

Sprawozdanie

Za pomocą arkusza kalkulacyjnego MS Excel wykreślić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć

równanie regresji liniowej zależności absorbancji od stężenia BSA (wzorca). Z równania regresji

odczytać zawartość białka w badanej próbce (mg/cm

3

). Wartość tą należy przemnożyć przez 7

(można założyć, że 6 cm

3

buforu ekstrahującego + 1g świeżej tkanki daje około 7 cm

3

mieszaniny) otrzymując zawartość białka w 1 g świeżej masy.