Filogenetyka

Katedra Genetyki, Hodowli i Biotechnologii

Roślin, SGGW

Dr inż. Magdalena Święcicka, dr hab. Marcin Filipecki

Filogenetyka



Cel

– rekonstrukcja historii ewolucji

wszystkich organizmów



Klasyczne podejście:

historia ewolucji jest odtwarzana na

podstawie porównań cech

morfologicznych i fizjologicznych

badanych organizmów.

Filogenetyka



Molekularne podejście:

zadaniem filogenetyki molekularnej jest

zrekonstruowanie związków filogenetycznych między

badanymi sekwencjami



Podstawowe założenie w filogenetyce molekularnej:



sekwencje przodka mutują w sekwencje potomków



podobne gatunki są genetycznie blisko spokrewnione

Mechanizmy ewolucji



Mutacje w genach

Mutacje są rozprzestrzeniane w

populacji poprzez dryf genetyczny i/lub

selekcję naturalną



Duplikacja i rekombinacja genów



tempo mutacji zależy od regionu w genomie, genie, rodzaju genu;



częściej obserwuje się podstawienia w III pozycji kodonów;

CCG (prolina) zmiana G na jakikolwiek nt nie powoduje zmiany

aminokwasu

CTG (leucyna) zmiana C-T nie powoduje zmian



zmiana SYNONIMICZNA



zmiana NIESYNONIMICZNA



częściej obserwuje się podstawienia typu tranzycji (puryna-

puryna, pirymidyna-pirymidyna) niż transwersji;



częściej obserwowane są podstawienia między aminokwasami

podobnymi do siebie, ze względu na swoje właściwości

biochemiczne, biofizyczne, np.:

izoleucyna – lecyna

walina – izoleucyna

Kwas asparaginowy – kwas glutaminowy

OBOWIĄZUJĄCE SYMBOLE AMINOKWASÓW

Symbol

3-literowy

znaczenie

kodony

A

Ala

Alanina

GCT, GCC, GCA, GCG

B

Asp, Asn

Asparagina, Asparaginian

GAT, GAC, AAT, AAC

C

Cys

Cysteina

TGT, TGC

D

Asp

Asparaginian

GAT, GAC

E

Glu

Glutaminian

GAA, GAG

F

Phe

Fenyloalanina

TTT, TTC

G

Gly

Glicyna

GGT, GGC, GGA, GGG

H

His

Histydyna

CAT, CAC

I

Ile

Izoleucyna

ATT, ATC, ATA

K

Lys

Lizyna

AAA, AAG

L

Leu

Leucyna

TTG, TTA, CTT, CTC, CTA, CTG

M

Met

Metionina

ATG

N

Asn

Asparagina

AAT, AAC

P

Pro

Prolina

CCT, CCC, CCA, CCG

Q

Gln

Glutamina

CAA, CAG

R

Arg

Arginina

CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG

S

Ser

Seryna

TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC

T

Thr

Treonina

ACT, ACC, ACA, ACG

V

Val

Walina

GTT, GTC, GTA, GTG

W

Trp

Tryptofan

TGG

X

Xxx

Nieznany

Y

Tyr

Tyrozyna

TAT, TAC

Z

Glu, Gln

Glutaminian, Glutamina

GAA, GAG, CAA, CAG

*

End

Terminator

TAA, TAG, TGA



rzadko obserwuje się podstawienia między

aminokwasami bardzo różniącymi się swoimi

właściwościami:

tryptofan – izoleucyna



rzadko obserwuje się podstawienia między

aminokwasami pełniącymi ważne role w białkach:

tryptofan (

T

G

G

) na kodon stop (

T

A

G

)



mutacje

missens

– jeden aminokwas zastępowany

innym



mutacje

nonsens

– terminacja translacji



zmiana ramki odczytu

Wyrazem analiz filogenetycznych są

drzewa

filogenetyczne

między cząsteczkami –

drzewo genów

lub organizmami –

drzewo gatunków

Korzeń

– wspólny przodek dla wszystkich taksonów

Gałąź

– obrazuje związki ewolucyjne między

porównywanymi jednostkami taksonomicznymi

Długość gałęzi

– zazwyczaj reprezentuje liczbę zmian,

które się zdarzyły w danej linii ewolucyjnej

Węzeł

– reprezentuje miejsce rozgałęzień jednostek

taksonimicznych (populacji, organizmu, genu).

Liść

– reprezentuje aktualnie analizowaną jednostkę

taksonomiczną



Drzewa

ukorzenione

i

nieukorzenione



znany wspólny przodek lub istnieje hipoteza na temat

wspólnego przodka / nieznany wspólny przodek



Topologia drzewa



Długość gałęzi (czas ewolucji, ilość zmian)

Przykładowe drzewa filogenetyczne

Po co konstruuje się drzewa filogenetyczne?

•Poznanie i zrozumienie historii ewolucyjnej
•Mapowanie różnicowania szczepów patogennych do

opracowania szczepionek

•Wsparcie dla epidemiologów
– Choroby infekcyjne
– Defekty genetyczne
• Narzędzie do przewidywania funkcji nowo odkrytych

genów

• Badania różnicowania układów biologicznych
• Poznanie ekologii mikroorganizmów

Filogenetyka zwana jest czasem

kladystyką

Klad

– zbiór potomków pochodzących od pojedynczego przodka

Podstawowe założenia kladystyki

:

1. każda grupa

organizmów

jest spokrewniona przez

pochodzenie od wspólnego przodka

2. kladogeneza ma charakter

bifurkacyjny

(rozwidlający się)

3. zmiany

w cechach pojawiają się w liniach

filogenetycznych z upływem czasu

Drzewo genów: bifurkacja – mutacja

Drzewo gatunków: bifurkacja – specjacja

Mutacja –

warunek niezbędny, ale nie zawsze wystarczający do

specjacji

Często zapominamy o:

I Domniemany znak równości między podobieństwem

zestawu cech (np. nukleotydów), a pochodzeniem

II Mutacje somatyczne ≠ mutacje genetyczne

Mutacja – DNA lub białka wydziela się z tkanek

somatycznych, dla filogenezy istotne są tylko mutacje

w gametach

III Cechy używane do budowy drzewa gatunków mają

się nijak do cech używanych do budowy drzewa

genów

Cechy, które mogą być użyte do budowy drzewa rzędów owadów:

Poruszanie się

Okrycie stwardniałym oskórkiem lub kokonem,

Widoczność niezupełnie rozwiniętych narządów

Widoczność niecałkowicie wykształconych i nie funkcjonujących

odnóży,

Widoczność zawiązków skrzydeł

Widoczność aparatu gębowego

Zdolność do aktywnego poruszania się

Pełne wykształcenie narządów lokomotorycznych

Pełne wykształcenie zmysłów

Obecność członowanych odnóży krocznych

Liczba członowanych odnóży krocznych

Obecność pseudopodiów

Liczba pseudopodiów

Geny, które bierze się najczęściej do budowy drzew genów:

Cytochrom B

NADH dehydrogenase subunit I (ND1)

18S RNA

28S RNA

Horyzontalny transfer genów

Niektóre domyślne założenia kladystyki:

• sekwencje są poprawne

• sekwencje są

homologiczne

Podobieństwo

– to wielkość obserwowalna, którą można

określić np. jako % identycznych aminokwasów.

Homologia

– określa

wspólne pochodzenie

porównywanych

genów (to może być wniosek wyciągnięty z analizy

podobieństwa)

Termin

homologiczne

oznacza

odziedziczone po

wspólnym przodku

Niektóre domyślne założenia kladystyki (cd):

• każda pozycja

w sekwencjach dopasowanych (alignment)

jest homologiczna z każdą odpowiednią pozycją w tym

dopasowaniu

• różnorodność sekwencji w danym zbiorze jest na tyle

duża, że zawiera filogenetyczne sygnały, odpowiednie do

rozwiązania postawionego problemu

Jakich sekwencji użyć ?

•DNA (mt, rDNA, powoli czy szybko ewoluujące)

– Bardzo szczegółowe, niejednolite tempo mutacji

•cDNA/RNA

– Użyteczne dla bardziej odległych sekwencji homologicznych

•Sekwencje białkowe

– Użyteczne do badania większości odległych sekwencji

homologicznych, możliwość konstrukcji bardzo rozległych

ewolucyjnie drzew, bardziej jednolite tempo zmienności

mutacyjnej, więcej elementów zmienności

Jacek Leluk

Interdyscyplinarne Centrum Modelowania Matematycznego i Komputerowego, Uniwersytet Warszawski

Sekwencje rybosomowego 16S RNA

•Występują we wszystkich organizmach

•Są wysoce konserwatywne

•Nadają się do konstruowania bardzo rozległych

ewolucyjnie drzew

•Znane dla kilkudziesięciu tysięcy organizmów, głównie

prokariotycznych

Co jest obliczane?



Topologia drzewa

–porządek (kolejność) odgałęzień i korzeń



Długość odgałęzień (czas ewolucji)



Sekwencje przodków



Wartości pokrewieństwa (np.

prawdopodobieństwo poszczególnych przemian)



Wiarygodność drzewa

Jacek Leluk

Interdyscyplinarne Centrum Modelowania Matematycznego i Komputerowego, Uniwersytet Warszawski

Dopasowywanie sekwencji

(Multiple Sequence Alignment)

• Dopasowanie spokrewnionych sekwencji w taki

sposób, żeby odpowiadające sobie pozycje

znajdowały się w tej samej kolumnie

• Wypełnienie brakujących miejsca kreskami

(delecje, insercje)

• Każda kolumna znaków staje się pojedynczym

elementem do dalszych obliczeń filogenetycznych

Dopasowanie i porównanie wielu sekwencji



Celem porównania wielu sekwencji jest ułożenie w

kolumnach aminokwasów (nukleotydów) pochodzących

od jednego aminokwasu (nukleotydu) w białku (genie)

wspólnego przodka we wszystkich sekwencjach od

niego pochodzących.

Wstawienie przerwy

Porównanie parami

Porównanie parami wszystkich sekwencji

- seq_1 & seq_ 2



0.91



seq_ 1 & seq_ 3



0.23



…



seq_ 8 & seq_ 9



0.87

Porównanie wielu sekwencji



W oparciu o

dendrogram przewodni

zaczyna

się porównywanie grup sekwencji.



Drzewo przewodnie

wskazuje, które

sekwencje są najbliższe – a więc najpierw

porównuje się te „łatwe”, a trudniejsze

zostawia się na potem.

Sekwencje nieułożone

a mthislgslyshktaktingsdeaskmewhf
b mthvslgsmyshktgrtingsdqaskkmewhy
c mshisitmyshktartidgseqaskmewhy
d mthipigsmyshktaravngseqasklqwhy
e mthipigsmystartincseqasklewhy

Porównanie wielu sekwencji

D

E

C

A

B

mthipigsmyshktaravngseqasklqwhy

mthipigsmys--tartincseqasklewhy

Porównanie wielu sekwencji

D

E

C

A

B

mthipigsmyshktaravngseqasklqwhy

mthipigsmys--tartincseqasklewhy

mthislgslyshktaktingsdeas-kmewhf

mthvslgsmyshktgrtingsdqaskkmewhy

Porównanie wielu sekwencji

D

E

C

A

B

mshisi-tmyshktartidgseqaskmewhy

mthipigsmyshktaravngseqasklqwhy

mthipigsmys--tartincseqasklewhy

mthislgslyshktaktingsdeas-kmewhf

mthvslgsmyshktgrtingsdqaskkmewhy

Porównanie wielu sekwencji

D

E

C

A

B

mshisi-tmyshktartidgseqas-kmewhy

mthipigsmyshktaravngseqas-klqwhy

mthipigsmys--tartincseqas-klewhy

mthislgslyshktaktingsdeas-kmewhf

mthvslgsmyshktgrtingsdqaskkmewhy

Sekwencje ułożone

a mthislgslyshktaktingsdeas-kmewhf
b mthvslgsmyshktgrtingsdqaskkmewhy
c mshisi-tmyshktartidgseqas-kmewhy
d mthipigsmyshktaravngseqas-klqwhy
e mthipigsmys--tartincseqas-klewhy

Metody obliczeniowe konstruowania drzew

filogenetycznych

•

Metody analizy odległościowe (distance methods)

– met. średnich połączeń – (UPGMA; unweighted pair group method

with arithmetic mean,

- met. przyłączania sąsiadów (NJ; neighbor joining)
- met. Fitch-Margoliash (FM)
- met. minimalnych odległości (ME)
•

Metody oparte na cechach (character based methods)

- met. największej oszczędności (MP; Maximum Parsimony)
- met. największej wiarygodności (ML; Maximum Likelihood)
•

Łączenie drzew - drzewa konsensusowe, superdrzewa

Budowa dendrogramu przewodniego

Skonstruowanie dendrogramu przewodniego w

oparciu o porównania parami



Metoda średnich połączeń

- UPGMA

– unweighted pair

group method with arithmetic mean (PileUp & Clustal
V)



Metoda przyłączania sąsiada

- Neighbor-Joining (NJ)

(Clustal W, Clustal X)

Metody odległościowe



Odległość wyrażana jest w ułamkach

miejsc, którymi różnią się między sobą 2

sekwencje w wielokrotnym przyrównaniu



Para sekwencji różniąca się w 10% miejsc
jest bliżej spokrewniona niż para różniąca
się w 30%.

Metody odległościowe

przodek linia potomna

liczba zmian

A

C – A

0

A

C – G

1

A

C

0

C

Metoda nieważona grupowania parami ze średnią

arytmetyczną UPGMA



program znajduje najpierw

parę taksonów

, którą

dzieli

najmniejsza różnica

i ustala

punkt

rozejścia

między nimi, czyli węzeł,

w

połowie

odległości

.



łączy je

w klaster i wpisuje do nowej macierzy

odległości dzielące ten klaster od pozostałych



powtarzanie

tych etapów, aż macierz zostanie

zredukowana do 1 obiektu

A B C D E

A

0 6 9 11 9

B

6 0 7

9 7

C

9 7 0

8 6

D 11 9 8

0 4

E

9 7 6

4 0

A B C DE

A

0

6

9

10

B

6

0

7

8

C

9

7

0

7

DE 10

8

7

0

AB C DE

AB

0

8

9

C

8

0

7

DE

9

7

0

AB CDE

AB

0

8.5

CDE

8.5

0

D

E

D

E

A

B

D

E

C

A

B

D

E

C

A

B

1.

2.

3.

4.

UPGMA



Hipoteza zegara molekularnego

– ewolucja

różnych gatunków zachodzi w takim samym

tempie (FAŁSZ)



Rzadko używana metoda przez filogenetyków,

nadal popularna w epidemiologii

drobnoustrojów

Metody odległościowe –

przyłączanie

sąsiadów (NJ)



umożliwia konstruowanie

nieukorzenionych

drzew



drzewa addytywne

– odległość pomiędzy

gatunkami reprezentowanymi przez liście drzewa

są równe sumie długości łączących je gałęzi

(odległości od obu taksonów do węzła nie muszą

być identyczne)

i

j

n

Metody oparte na cechach



metoda

największej oszczędności

(MP)



metoda

największej wiarygodności

(ML)

Metoda największej oszczędności (MP)



Metoda

parsymonii

(oszczędności) –

najodpowiedniejsze jest takie drzewo, w

którym potrzebujemy najmniejszej liczby

zmian do wyjaśnienia danych występujących

jako przyrównanie sekwencji.

Kryterium parsymonii

A B

C D

+

A

D C

B

+

*

A

C D

B

+ +

Które drzewo jest najprostszym wytłumaczeniem
obserwowanego zróżnicowania cechy między gatunkami?

+ wykształcenie się cechy

* utracenie cechy

Metoda największej wiarygodności



Poszukiwanie drzewa, które zgodnie z określonym

modelem ewolucji maksymalnie uwiarygodnia dane.



Wiarygodność obliczamy dla:



topologii drzewa



długości gałęzi



wartości wskaźników tempa podstawień (częstość występowania

zasady, liczba tranzycji / liczby transwersji)



Wyznaczenie wartości ML może posłużyć do utworzenia

rankingu alternatywnych drzew.

Metoda bootstrap



Pozwala oszacować wiarygodność rozgałęzień w

drzewach



Porównuje topologię drzewa dla losowo

wygenerowanych dopasowań sekwencji (100 –

1000 dopasowań)



Drzewo z

wartościami bootstrap

(odsetek

wygenerowanych drzew, w których obserwowano

dokładnie takie samo rozgałęzienie linii

ewolucyjnych)

Dobór właściwego algorytmu

•Niedyskretny charakter zmiennych jednostek, duża ilość

danych, niewielkie zasoby obliczeniowe ==> Metoda

najbliższego sąsiedztwa (Neighbor joining)

•Dyskretny charakter zmiennych, niewielka liczba

mutacji/homoplazja ==> Maximum Parsimony

•Dyskretny charakter zmiennych, ograniczona długość

sekwencji, występowanie zjawiska homoplazji

==>Maximum Likelihood

• Dyskretny charakter zmiennych, wiele gatunków

==>Superdrzewo

•Kompletne genomy ==>Filogeneza całych genomów