Katedra Fizyki i Biofizyki – instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku Lekarskiego

1

Ćw. M8

Zjawisko absorpcji i emisji światła w analityce. Pomiar widm absorpcji i

stężenia ryboflawiny w roztworach wodnych za pomocą spektrofotometru.

Wyznaczanie stężeń substancji w roztworze metodą fluorescencyjną.

Zagadnienia

Kwantowa teoria światła.

Struktura energetyczna cząsteczki.

Zjawisko absorpcji. Prawo Lamberta Beera.

Wielkości służące do ilościowego opisu zjawiska absorpcji.

Zjawisko fluorescencji. Prawa związane z tym zjawiskiem.

Wielkości służące do ilościowego opisu zjawiska fluorescencji.

Widma absorpcji i fluorescencji.

Wykorzystanie metod spektroskopowych w analizie ilościowej i jakościowej.

Opis ćwiczenia:

W ćwiczeniu mierzymy absorbancję i fluorescencję serii roztworów ryboflawiny. Na

podstawie zmierzonych widm analizujemy zależność absorpcji i fluorescencji światła od

stężenia substancji.

Należy sporządzić krzywą wzorcową, znaleźć jej równanie i na jego podstawie

wyznaczyć nieznane stężenie roztworu C

x

, korzystając z danych uzyskanych zarówno z

pomiarów absorpcyjnych jak i fluorescencyjnych. .

Instrukcja

1. Wykonaj serię roztworów ryboflawiny o stężeniach zadanych przez prowadzącego

ćwiczenia.

2. Włącz komputer.

3. Włącz spektrometr M42.

O i

UV

M42

włącznik

komora pomiarowa (otwierać
podnosząc do góry)

Katedra Fizyki i Biofizyki – instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku Lekarskiego

2

4. Włącz oprogramowanie AspectPlus (ikona na pulpicie).

5. Znajdź na pasku zadań Measurement, rozwiń, wybierz Init Device i poczekaj, aż

zainicjuje się połączenie z aparatem.

6. W tym samym Menu wybierz: Set parameters i upewnij się, że ustawienia są takie same

jak w podanym niżej przykładzie. Jeśli nie - na rozwiniętym pasku wybierz:

1 D:\MEDYCYNA\RFL.PAR i ponownie sprawdź ustawienia parametrów pomiarowych

(Set parameters). Ustawione tu

będzie m.in. w jakim zakresie

długości fal, z jaką dokładnością i

szybkością będzie prowadzony

pomiar.

Katedra Fizyki i Biofizyki – instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku Lekarskiego

3

7. Wstaw do komory pomiarowej (klapkę podnosi się do góry) dwie kuwety: jedną z wodą

destylowaną, drugą z roztworem mierzonym (najlepiej zacząć od roztworu najmniej

stężonego i skończyć na roztworze wyjściowym).

8. W menu Measurement wybierz Measuere. Rozpocznie się pomiar widma absorpcji

danego roztworu. W trakcie pomiaru dostępne będą polecenia: Stop i Scale. Można wejść

w Scale i dostosować sobie podziałkę na osi absorbancji. Wszelkie komunikaty jakie

pojawią się po zmierzeniu widma akceptuj przez kliknięcie OK.

9. Po skończonym pomiarze należy odczytać przy jakiej długości fali pojawia się

maksimum absorbancji. W tym celu trzeba wejść w polecenie Data Handing a następnie

Analysis i Peak. Po wybraniu pojawi się komunikat dotyczący parametrów wybieranego

piku. Ważne aby było zaznaczone, że poszukujemy maksimum. Po wybraniu OK pojawi

się informacja o wartości absorbancji w maksimum oraz o długości fali przy jakiej to

maksimum występuje. Informacje te należy spisać do tabeli, nie zapominając o wartości

stężenia jakie miała mierzona ryboflawina.

kuweta z roztworem
referencyjnym (z tyłu)

kuweta z roztworem
pomiarowym (z przodu)

Katedra Fizyki i Biofizyki – instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku Lekarskiego

4

10. Następnie należy wymienić mierzony roztwór i powtórzyć operację od punktu 8.

Katedra Fizyki i Biofizyki – instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku Lekarskiego

5

11. Przejdź na stanowisko do pomiaru fluorescencji i zmierz fluorescencję badanych

roztworów przy długości fali równej

max

absorpcji.

12. Uzyskane wyniki opracuj w programie GraphPad Prism według podanej instrukcji.

13. Znając równanie prostej policz C

x

(stężenie nieznane roztworu ryboflawiny)z pomiarów

absorpcyjnych i fluorescencyjnych. Oszacuj niepewność uzyskanych wyniku.

14. Poproś prowadzącego o wydrukowanie wykresów

max

= ……….

Lp.

stężenie

A

max

I

max

( A)

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

c

x