Barwienie komórek, analiza

mikroskopowa obrazu

Barwienie May-Grünwalda-Giemsy

Umożliwia uwidocznienie

zmian morfologicznych komórek

pod wpływem badanej substancji.

Zastosowanie dwóch barwników

umożliwia obserwacje jądra

komórkowego wybarwionego na

kolor fioletowy z ciemniejszymi

jąderkami (barwnik Giemsy wiąże

się do DNA), oraz cytoplazmy

przybierającej niebiesko-różową

barwę (May-Grünwald).

W przypadku bazofili możliwa

jest obserwacja ciemnoniebieskich

granul w cytoplazmie a eozynofili

jasno pomarańczowych. Erytrocyty

barwią się na różowo.

Barwnik May-Grünwalda

Barwnik Giemsy (błękit
metylenowy)

Hodowla kontrolna

Zmiany morfologii komórek pod
wpływem badanej substancji.

Zmiany morfologii

Wound assay - test „z rysą”

Aby oszacować potencjalną

zdolność badanej substancji do

hamowania migracji komórek

przeprowadza się tak zwany test „z

rysą”. Umożliwia on porównanie

liczby komórek migrujących w grupie

kontrolnej (bez substancji) z liczbą

komórek migrujących w grupie

badanej (z odpowiednimi stężeniami

substancji). Liczenie komórek

zasiedlających obszar rysy wykonanej

w zwartej monowarstwie, umożliwia

określenie zdolności do hamowania

przez substancję procesów

przemieszczania się komórek

(związanej ze zdolność tworzenia

przerzutów w przypadku wielu

nowotworów).

Rysa (wound)

Kontrola

Zahamowanie
migracji
komórek

Neutral Red (NR)

Wychwyt czerwieni obojętnej

polega na pobieraniu barwnika NR

(będącego słabym kationem), przez żywe

komórki i gromadzeniu go w lizosomach

(pH lizosomów < pH cytoplazmy, co

umożliwia NR wiązanie się miejscami

anionowymi do macierzy lizosomalnej).

Komórki martwe lub uszkodzone nie

pobierają NR. Dodatkowo ilość

pochłoniętego barwnika jest wprost

proporcjonalna do ilości żywych komórek

co umożliwia przeprowadzenie pomiaru

metodami spektrofotometrycznymi.

Morfologia komórek barwionych

NR.

a) RTG-2 (gonady Oncorhynchus mykiss)

b) PLHC-1 (nowotwór wątroby Poeciliopsis

lucida)

c) SH-SY5Y (ludzka neuroblastoma) po 24h

ekspozycji na d)1 e)20 f)50 mg/ml chlorku

cynku.

Barwienie błękitem trypanu

Proste barwienie dające możliwość oceny żywotności populacji komórek.

Barwnik przenika do komórek przez uszkodzoną błoną komórkową, barwiąc je na
niebiesko. Nie pozwala rozróżnić komórek nekrotycznych i apoptotycznych.

Komórka umierająca na drodze

apoptozy

•

Liczne pofałdowania błony komórkowej.

•

Zagęszczenie cytoplazmy w wyniku utraty wody przez
komórkę.

•

Zmniejszenie objętości komórki.

•

Kondensacja chromatyny i jej lokalizacja w pobliżu błony
jądrowej.

•

Obkurczanie jądra komórkowego i jego fragmentacja.

•

Fragmentacja DNA na odcinki będące wielokrotnością
nukleosomów (180-200 par zasad).

•

Powstawanie ciałek apoptotycznych.

Komórki umierające na drodze nekrozy

1.

Powstają agregaty chromatyny, dochodzi do przypadkowej
degradacja DNA.

2.

Zwiększeni objętość komórki, pęcznienie organelli oraz ich
rozpad.

3.

Drastyczny spadek poziomu ATP w komórce.

4.

Cytoplazma ulega silnej wakuolizacji.

5.

Uszkodzenie błon powoduje że zawartość komórek wylewa
się do przestrzeni międzykomórkowej.

6.

Indukcja stanu zapalnego.

7.

Komórki utworzą charakterystyczne skupiska, jako że
nekroza obejmuje zwykle zwarte grupy komórek

Wykrywanie

apoptozy

Barwienie hematoksyliną i
eozyną

•

Hematoksylina –barwnik
zasadowy, łączący się z
białkami jądra wybarwiając je
na niebiesko. Umożliwia ocenę
stopnia kondensacji
chromatyny i obserwację ciałek
apoptotycznych

•

Eozyna – barwnik kwasowy,
wybarwia białka cytoplazmy na
różowo

apoptotyczne

hepatocyty barwione

eozyną i hematoksyliną

Hematoksylina

Eozyna Y

Wykrywanie apoptozy – barwienia

fluoroscencyjne.

Fluorescencyjne barwienie

oranżem akrydyny (OA) i

bromkiem etydyny (BE).

Cząsteczki barwnika interkalują

pomiędzy dsDNA, co można

zaobserwować w mikroskopie

fluorescencyjnym. OA wnikając

do jąder komórek

apoptotycznych zawierających

skondensowaną chromatynę

doprowadza do intensywnego

zielonego świecenia (szczególnie

na obrzeżach). OA ma również

zdolność do łączenia się z RNA

doprowadzają do emisji

czerwonego światła. Natomiast

BE wnika do komórek z

uszkodzoną błoną, wywołując

czerwoną lub pomarańczową

fluorescencję jądra.

Limfocyty barwione OA/BE

A) Prawidłowa komórka

B) Komórka z uszkodzoną błoną

C) Komórki apoptotyczne

D) artefakt

Barwienie OA i BE

oranż akrydyny

bromek etydyny

Barwienie jodkiem propidyny i

Hoechst 33342

Hoechst 33342 (bis-benzimid) wzbudza niebieskie
świecenie jądra komórek żywych łącząc się do dsDNA w
miejscach bogatych a A i T. Natomiast pojedyncze
cząsteczki jodku propidyny (IP) łączą się co 4-5 par zasad
do dsDNA umożliwiając obserwację czerwonej
fluorescencji skondensowanych jąder komórek
apoptotycznych.

jodek propidyny

Hoechst 33342

Ciałka apoptotyczne

Inne barwniki fluorescencyjne (UV)

DAPI (4',6-diamidyno-2-
fenyloindol) – związek
interkalujący używany do
barwienia jąder i chromosomów.
W UV świeci na niebiesko

Red CMXRos – barwi
mitochondria żywych komórek na
czerwono

Alexa Fluor (AF) – pochodne
kumaryny, rodaminy i ksantenu
poddane sulfonacji (R-SO

2

O-). AF

488 to barwnik sprzężony z
falloidyną łączącą się specyficznie
z włóknami F-aktyny. Barwniki z tej
grupy działające na zasadzie sąd
molekularnych (np. sprzężone z Ig)
umożliwiając różnobarwne
znakowanie określonych struktur.

C. Elegans
barwiony
DAPI

Red CMXRos
Mięśnie
gładkie
szczura

Alexa Fluor 488
barwiący
włókna
aktynowe