Wykład 6

23.03

Analiza produktów PCR

Co należy zrobić, aby produkty były specyficzne?

Wpływ ma długość starterów → temperatura hy-

•

brydyzacji → temperatura syntezy. Przy odpowiednim

doborze wszystkich tych aspektów otrzymujemy spe-

cyficzny produkt.
Co po PCR?

elektroforeza (najłatwiejsza metoda analizy pro-

•

duktu PCR)

RFPL - trawienie enzymem restrykcyjnym – naj-

•

częściej do sprawdzenia zachodzącej mutacji

klonowanie

•

W reakcji PCR wykorzystywana jest polimeraza

Tag, a zatem otrzymujemy produkty o końcach tępych.

Polimeraza Tag posiada szczątkową aktywność termi-

nalnej transferazy.

Aby otrzymać lepkie końce dodajemy reszty A na

końcach cząsteczki, a w wektorze komplementarne

reszty T.
Jak można zrobić to ‘samemu‘?

Należy wektor przygotować poprzez przecięcie en-

zymem dającym końce tępe. Następnie użyć polimera-

zy Tag i tylko jednego nukleotydu, wtedy uzyskujemy

wektor gotowy do klonowania. {...}

Produkty PCR można też klonować w sposób bar-

dziej specyficzny – przy zachowaniu ramki odczytu.

Korzystamy wówczas z miejsc restrykcyjnych – różne

możliwości:

Wykorzystujemy istnieące miejsce restrykcyj-

•

ne w produkcie PCR. Patrzymy wówczas, czy takie

miejsce istnieje w wektorze, jest komplementarne, jest

zachowana ramka odczytu. Wybieramy takie startery,

by cząsteczka DNA zawierała miejsca restrykcyjne, po

PCR trawimy i produkt posiada lepkie końce i może

być klonowany.

Sekwencja restrykcyjna nie występuje w sekwen-

•

cji amplifikowanej. W tym przypadku starter jest tak

zaprojektowany, iż miejsce restrykcyjne jest zawarte

w sekwencji startera, ale nie występuje w matrycy. W

pierwszej hybrydyzacji ta sekwencja nie paruje z ma-

trycą, ale w kolejnych cyklach otrzymujemy produkty

już z danym miejscem restrykcyjnym.

Lepiej gdy za miejscem restrykcyjnym występuje co

najmniej kilka reszt, wtedy jest wydajniejsze trawienie

(niektóre enzymy nie trawią, gdy miejsce restrykcyjne

jest na początku).
Polimeraza Tag

enzym termostabilny

•

aktywność polimerazowa

•

szczątkowa aktywność terminalnej transferazy

•

nie posiada aktywności nukleazowej

•

brak aktywności korekcyjnej – zatem polimeraza

•

się myli i trzeba być tego świadomym (1 błąd na 10000)

Za mutację jest odpowiedzialny zły dobór substra-

tów, czyli dNTPów (czasem celowo dodaje się nadmiar

jednego dNTP, aby wprowadzić przypadkowe mutacje).

Zatem przy ustalaniu sekwencji należy przebadać

kilka różnych klonów z biblioteki produktów, aby wy-

kluczyć cząsteczki posiadające mutacje powstałe przez

polimerazę Tag. Z reguły do sekwencjonowania uży-

wamy polimerazy z aktywnością poreakcyjną. Polime-

raza Tag jest łatwa i wygodna w użyciu, zatem najczę-

sciej używamy jej, gdy nie zależy nam na dokładnej

znajomości sekwencji.

Real-time PCR

(ilościowy PCR w czasie rzeczywistym)

Ilość produktu na końcu reakcji zależy od ilości

•

substratuna początku reakcji – prosta zależność leżąca

u podstaw RT-PCR

Im więcej substratu na początku, tym szybciej

•

zauważymy produkt metody: określenie ilości DNA w

próbce.

Po co? Żeby określać różne problemy ilościowe.

Cóż za błyskawiczna odpowiedź!

Podstawa techniki – pomiar produktu w czasie, róż-

ne sposoby:

W mieszaninie reakcyjnej obecna substancja

•

która fluoryzuje po związaniu z cząsteczką dsDNA.

Urządzenie mierzy stężenie fluorescencji. Wadą jest,

że może parować również do startorów dając błędny

obraz.

Amplifikowane DNA jest przyłączane do skon-

•

struowanej, komplementarnej sondy.

Sonda

Sonda

oligonukleotydowa

DNA docelowe

DNA

Na końcach sondy znajdują się cząsteczki, które po-

siadają następujące właściwości: jedna z nich fluoryzu-

je, druga natomiast znosi fluorescencję pierwszej.

Sonda – oligonukleotyd, który po obniżeniu tempe-

ratury hybrydyzuje z produktem i fluoryzuje.

P

W (1) było najwięcej DNA, ponieważ potrzeba było

mniej cykli, aby osiągnąć wymaną ilość produktu. W 2

i 3 wymagana była większa ilość cykli.

Sygnał jest mierzony dla konkretnej wartości, który

jest dostatecznie pewny, tzw. próg pomiaru.

Po ustaleniu progu pomiaru mierzy się, po jakiej

liczbie cykli próbka przekroczy próg pomiaru.

RT-PCR może też słżyć do analizy ilości transkryp-

tu (nie tylko DNA), wygląda jak standardowy PCR, ale

najpierw musimy uzyskać matrycę. Potrzebujemy od-

wrotnej transkryptazy.

fragment Klenowa – pozbawiony aktywności

•

nukleazowej 5’→3’. Problemem jest to, że jest mało

procesywny (jest dłgo związany z matrycą).

sekwenaza – pochodna polimerazy z faga T7. Nie

•

posiada aktywności egzonukleazowej 5’→3’, wysoko

procesywna (ponad 700 pz), akceptuje pochodne nu-

kleotydów.

Skąd pojedyncza nić? Na przykład z faga M13, ale

fragmenty nie są długie; użycie fagemidów; denatura-

cja DNA.

Sekwencjonowanie termiczne

Po pierwsze cząsteczka DNA jest denaturowana

przez temperaturę. Następnie, w konkretnej tempera-

turze jedna z nici hybrydyzuje ze starterem. Produkt

jest syntezowany przez polimerazę termostabilną. Jest

obecny tylko jeden starter. Nie ma amplifikacji sekwen-

cji tylko w kolejnych cyklach produkt jest syntezowa-

ny. Mówimy o tak zwanym PCR asymetrycznym.

Podobnie jak w metodzie Sangera, w sekwencjono-

waniu termicznym znajdują się dNTP oraz ddNTP. W

metodzie tej zachodząmutacje, ale nie mają one więk-

szego znaczenia, gdyż nie są powielane, a mutacje,

które nawet powstały są ‘tłumione’ przez cząsteczki

niezmutowane.

Startery używane do sekwencjonowania

Starter musi być komplementarny do sekwencjo-

•

nowanej cząsteczki.

Starter uniwersalny jest komplementarny do

•

wektora i sekwencjonuje DNA insertu (dowolnego).

Wygodna metoda, bo nie znamy DNA insertu, a zatem

trudno byłoby znaleźć odpowiedni starter. Jedynym

warunkiem jest odpowiednia długość startera.

Startery wewnętrzne są używane, gdy dłgość in-

•

sertu jest zbyt długa. Najpierw używamy startera uni-

wersalnego, by zbadać część sekwencji, a po jej pozna-

niu zaczynamy używać ognia, bo trzeba się wykazać

niezwykłym wyczuciem w ich projektowaniu. Lepiej

używać uniwersalnych.

Standardowe PCR

RNA

RNA

Odwrotna transkryptaza

Degradacja nici RNA

Do czego jest nam to potrzebne?

do wykrywania wirusów patogennych z RNA

•

do analizy ekspresji genu

•

Sekwencjonowanie genów i genomów

Początki sekwencjonowania sięgają lat 70’ ubiegłe-

go wieku.

Metoda Sangera – używana do sekwencjonowania

małych genomów. Metoda ta wykorzystuje techniki

elektroforezy wykonywanej w szczególnych warun-

kach – odróżniane są produkty różniące się jednym nu-

kleotydem. W tej metodzie stosowany jest wysokoroz-

dzielczy żel poliakryloamidowy i cząsteczki DNA są

całkowicie zdenaturowane. Denaturacje uzyskuje się

dzięki mocznikowi oraz temperaturze.

Opis metody: Dysponujemy (jednoniciowym)

DNA. Jednoniciowy, bo wykorzystujemy reakcję po-

limerazową. Do reakcji wykorzystujemy dNTP, ma-

trycę, startery, polimerazę oraz dideoksynukleotydy

(związek ten w pozycji 3 nie posiada grupy OH, tylko

H, grupa OH potrzebna jest do wydłużania łańcucha).

Należy pamiętać, że dNTP → ddNTP (dideoksynukle-

otydów). Otrzymujemy kolekcję DNA o różnych dłu-

gościach. W zależności od tego, w których miejscach

został przyłączony ddNTP. Dodatkowy każdy ddNTP

jest znakowany różnym kolorem fluorescencyjnym.

Przy pomocy elektroforezy i detektora. Otrzymujemy

informacje na temat długości {...}

Polimerazy używane do sekwencjonowania:

polimeraza DNA1 – (na początku) posiada ak-

•

tywność nukleazową, co prowadziło do hydrolizy pro-

duktów.