Wykład 6 

 23.03

Analiza produktów PCR

Co należy zrobić, aby produkty były specyficzne?

Wpływ ma długość starterów → temperatura hy-

• 

brydyzacji → temperatura syntezy. Przy odpowiednim 

doborze wszystkich tych aspektów otrzymujemy spe-

cyficzny produkt.
Co po PCR?

elektroforeza (najłatwiejsza metoda analizy pro-

• 

duktu PCR)

RFPL - trawienie enzymem restrykcyjnym – naj-

• 

częściej do sprawdzenia zachodzącej mutacji

klonowanie

• 

W  reakcji  PCR  wykorzystywana  jest  polimeraza 

Tag, a zatem otrzymujemy produkty o końcach tępych. 

Polimeraza Tag posiada szczątkową aktywność termi-

nalnej transferazy.

Aby otrzymać lepkie końce dodajemy reszty A na 

końcach  cząsteczki,  a  w  wektorze  komplementarne 

reszty T.
Jak można zrobić to ‘samemu‘?

Należy wektor przygotować poprzez przecięcie en-

zymem dającym końce tępe. Następnie użyć polimera-

zy Tag i tylko jednego nukleotydu, wtedy uzyskujemy 

wektor gotowy do klonowania. {...}

Produkty PCR można też klonować w sposób bar-

dziej  specyficzny  –  przy  zachowaniu  ramki  odczytu. 

Korzystamy wówczas z miejsc restrykcyjnych – różne 

możliwości:

Wykorzystujemy  istnieące  miejsce  restrykcyj-

• 

ne  w  produkcie  PCR.  Patrzymy  wówczas,  czy  takie 

miejsce istnieje w wektorze, jest komplementarne, jest 

zachowana ramka odczytu. Wybieramy takie startery, 

by cząsteczka DNA zawierała miejsca restrykcyjne, po 

PCR trawimy i produkt posiada lepkie końce i może 

być klonowany.

Sekwencja restrykcyjna nie występuje w sekwen-

• 

cji amplifikowanej. W tym przypadku starter jest tak 

zaprojektowany,  iż  miejsce  restrykcyjne  jest  zawarte 

w sekwencji startera, ale nie występuje w matrycy. W 

pierwszej hybrydyzacji ta sekwencja nie paruje z ma-

trycą, ale w kolejnych cyklach otrzymujemy produkty 

już z danym miejscem restrykcyjnym.

Lepiej gdy za miejscem restrykcyjnym występuje co 

najmniej kilka reszt, wtedy jest wydajniejsze trawienie 

(niektóre enzymy nie trawią, gdy miejsce restrykcyjne 

jest na początku).
Polimeraza Tag

enzym termostabilny

• 

aktywność polimerazowa

• 

szczątkowa aktywność terminalnej transferazy

• 

nie posiada aktywności nukleazowej

• 

brak  aktywności  korekcyjnej  –  zatem  polimeraza 

• 

się myli i trzeba być tego świadomym (1 błąd na 10000)

Za  mutację  jest  odpowiedzialny  zły  dobór  substra-

tów, czyli dNTPów (czasem celowo dodaje się nadmiar 

jednego dNTP, aby wprowadzić przypadkowe mutacje).

Zatem  przy  ustalaniu  sekwencji  należy  przebadać 

kilka różnych klonów z biblioteki produktów, aby wy-

kluczyć cząsteczki posiadające mutacje powstałe przez 

polimerazę Tag. Z reguły do sekwencjonowania uży-

wamy polimerazy z aktywnością poreakcyjną. Polime-

raza Tag jest łatwa i wygodna w użyciu, zatem najczę-

sciej używamy jej, gdy nie zależy nam na dokładnej 

znajomości sekwencji.

Real-time PCR

(ilościowy PCR w czasie rzeczywistym)

Ilość produktu na końcu reakcji zależy od ilości 

• 

substratuna początku reakcji – prosta zależność leżąca 

u podstaw RT-PCR

Im  więcej  substratu  na  początku,  tym  szybciej 

• 

zauważymy produkt metody: określenie ilości DNA w 

próbce.

Po  co?  Żeby  określać  różne  problemy  ilościowe. 

Cóż za błyskawiczna odpowiedź!

Podstawa techniki – pomiar produktu w czasie, róż-

ne sposoby:

W  mieszaninie  reakcyjnej  obecna  substancja 

• 

która  fluoryzuje  po  związaniu  z  cząsteczką  dsDNA. 

Urządzenie  mierzy  stężenie  fluorescencji.  Wadą  jest, 

że może parować również do startorów dając błędny 

obraz.

Amplifikowane DNA jest przyłączane do skon-

• 

struowanej, komplementarnej sondy.

Sonda

Sonda

oligonukleotydowa

DNA docelowe

DNA

Na końcach sondy znajdują się cząsteczki, które po-

siadają następujące właściwości: jedna z nich fluoryzu-

je, druga natomiast znosi fluorescencję pierwszej.

Sonda – oligonukleotyd, który po obniżeniu tempe-

ratury hybrydyzuje z produktem i fluoryzuje.

P 

W (1) było najwięcej DNA, ponieważ potrzeba było 

mniej cykli, aby osiągnąć wymaną ilość produktu. W 2 

i 3 wymagana była większa ilość cykli.

Sygnał jest mierzony dla konkretnej wartości, który 

jest dostatecznie pewny, tzw. próg pomiaru.

Po  ustaleniu  progu  pomiaru  mierzy  się,  po  jakiej 

liczbie cykli próbka przekroczy próg pomiaru.

RT-PCR może też słżyć do analizy ilości transkryp-

tu (nie tylko DNA), wygląda jak standardowy PCR, ale 

najpierw musimy uzyskać matrycę. Potrzebujemy od-

wrotnej transkryptazy.

fragment  Klenowa  –  pozbawiony  aktywności 

• 

nukleazowej 5’→3’. Problemem jest to, że jest mało 

procesywny (jest dłgo związany z matrycą).

sekwenaza – pochodna polimerazy z faga T7. Nie 

• 

posiada aktywności egzonukleazowej 5’→3’, wysoko 

procesywna (ponad 700 pz), akceptuje pochodne nu-

kleotydów.

Skąd pojedyncza nić? Na przykład z faga M13, ale 

fragmenty nie są długie; użycie fagemidów; denatura-

cja DNA.

Sekwencjonowanie termiczne

Po  pierwsze  cząsteczka  DNA  jest  denaturowana 

przez  temperaturę.  Następnie,  w  konkretnej  tempera-

turze  jedna  z  nici  hybrydyzuje  ze  starterem.  Produkt 

jest syntezowany przez polimerazę termostabilną. Jest 

obecny tylko jeden starter. Nie ma amplifikacji sekwen-

cji tylko w kolejnych cyklach produkt jest syntezowa-

ny. Mówimy o tak zwanym PCR asymetrycznym.

Podobnie jak w metodzie Sangera, w sekwencjono-

waniu termicznym znajdują się dNTP oraz ddNTP. W 

metodzie tej zachodząmutacje, ale nie mają one więk-

szego  znaczenia,  gdyż  nie  są  powielane,  a  mutacje, 

które  nawet  powstały  są  ‘tłumione’  przez  cząsteczki 

niezmutowane.

Startery używane do sekwencjonowania

Starter musi być komplementarny do sekwencjo-

• 

nowanej cząsteczki.

Starter  uniwersalny  jest  komplementarny  do 

• 

wektora  i  sekwencjonuje  DNA  insertu  (dowolnego). 

Wygodna metoda, bo nie znamy DNA insertu, a zatem 

trudno  byłoby  znaleźć  odpowiedni  starter.  Jedynym 

warunkiem jest odpowiednia długość startera.

Startery wewnętrzne są używane, gdy dłgość in-

• 

sertu jest zbyt długa. Najpierw używamy startera uni-

wersalnego, by zbadać część sekwencji, a po jej pozna-

niu zaczynamy używać ognia, bo trzeba się wykazać 

niezwykłym wyczuciem w ich projektowaniu. Lepiej 

używać uniwersalnych.

Standardowe PCR

RNA

RNA

Odwrotna transkryptaza

Degradacja nici RNA

Do czego jest nam to potrzebne?

do wykrywania wirusów patogennych z RNA

• 

do analizy ekspresji genu

• 

Sekwencjonowanie genów i genomów

Początki sekwencjonowania sięgają lat 70’ ubiegłe-

go wieku.

Metoda Sangera – używana do sekwencjonowania 

małych  genomów.  Metoda  ta  wykorzystuje  techniki 

elektroforezy  wykonywanej  w  szczególnych  warun-

kach – odróżniane są produkty różniące się jednym nu-

kleotydem. W tej metodzie stosowany jest wysokoroz-

dzielczy żel poliakryloamidowy i cząsteczki DNA są 

całkowicie  zdenaturowane.  Denaturacje  uzyskuje  się 

dzięki mocznikowi oraz temperaturze.

Opis  metody:  Dysponujemy  (jednoniciowym) 

DNA. Jednoniciowy, bo wykorzystujemy reakcję po-

limerazową.  Do  reakcji  wykorzystujemy  dNTP,  ma-

trycę,  startery,  polimerazę  oraz  dideoksynukleotydy 

(związek ten w pozycji 3 nie posiada grupy OH, tylko 

H, grupa OH potrzebna jest do wydłużania łańcucha). 

Należy pamiętać, że dNTP → ddNTP (dideoksynukle-

otydów). Otrzymujemy kolekcję DNA o różnych dłu-

gościach. W zależności od tego, w których miejscach 

został przyłączony ddNTP. Dodatkowy każdy ddNTP 

jest  znakowany  różnym  kolorem  fluorescencyjnym. 

Przy pomocy elektroforezy i detektora. Otrzymujemy 

informacje na temat długości {...}

Polimerazy używane do sekwencjonowania:

polimeraza  DNA1  –  (na  początku)  posiada  ak-

• 

tywność nukleazową, co prowadziło do hydrolizy pro-

duktów.