Mutageneza z otrzymanie całego szeregu mutantów:

1. Mamy gen którego fragment odpowiada sekwencji kodującej reszty istotne dla aktywności

enzymu oraz miejsca restrykcyjne R1 i R2 otaczające te sekwencję czyli kasetę.

2. Zamiast wprowadzać różne mutację i badać ich efekt a także efekt kilku mutacji jednocześnie

(może zachodzić synergizm) wykonujemy bibliotekę oligonukleotydów odpowiadające tej
kasecie. Biblioteka zawiera dla każdej pozycji i kombinacji pozycji, różne sekwencję

3. Bibliotekę poddaje się ligacji z wektorem.
4. Otrzymujemy bibliotekę fagów – tysiące mutantów
5. Biblioteką fagów poddajemy transformacji komórki bakteryjne.
6. Otrzymujemy bibliotekę w postaci kolekcji klonów które są dalej analizowane pod kontem

aktywności

W ten sposób postępując otrzymuje się nowe białka o nowych ulepszonych właściwościach.

Mutageneza sterowana oligonukleotydowo:



Sekwencja normalna – typu dzikiego



Oligonukleotyd wprowadza mutację – w tym wypadku punktową. Jest w części
komplementarny do sekwencji typu dzikiego, po za miejscem które wprowadza mutację. W
ten sposób można też wprowadzać delecję czy insercję



Mutacja jest racjonalnie wprowadzona do sekwencji oligonukleotydu



Sekwencja typu dzikiego w tym wypadku to sekwencja w kolistym wektorze M13(pojedyncza
nić) ale może być to inny kulisty genom.



ssDNA hybrydyzuje z nukleotydem



Przy użyciu polimerazy DNA i dNTP-ów otrzymujemy cząsteczkę typu dsDNA



Tym wektorem transformujemy komórki bakteryjne



W bakteriach zachodzi replikacja DNA i podział komórek. Replikacja dotyczy obu nici!



Otrzymujemy 2 typy komórek – jedne z DNA typu dzikiego a drugie ze zmutowanym
DNA(obie nici) w zależności od nici macierzystej która została użyta do syntezy DNA tej
komórki



Bakterie identyfikuje się po wysianiu na podłoże stałe w odpowiedniej gęstości tak by
możliwe było rozróżnienie klonów.



Problemy pojawiają się w komórce na poziomie replikacji (?) ale sama metoda jest łatwa

Poszczególne metody mutagenezy różnią się wydajnością gdyż metody te mają różne cele i problemy
do rozwiązania

Mutageneza przy pomocy PCR (mutageneza z wykorzystaniem megaprimera)



Istotą techniki megaprimera(mega startera) jest to że wykonujemy 2 reakcje PCR



Technika ta jest bardzo wydajna dla wprowadzania mutacji punktowych – jeśli wszystko jest
dobrze wykonane to mamy praktycznie 100% pewność że mutacja została wprowadzona



W pierwszej reakcji korzystamy z 2 starterów – jeden zawiera mutację(forward – przedni) i ją
wprowadza a drugi nie zawiera mutacji



Otrzymujemy produkt w którym jest mutacja



W drugiej reakcji znowu posługujemy się dwoma starterami: starter przedni nie zawiera
mutacji a drugim starterem jest produkt reakcji pierwszej – jest bardzo długi więc jest
megaprimerem



Po wykonaniu drugiego PCR otrzymujemy produkt który jest identyczna do sekwencji
wyjściowej z tą różnicą że wprowadziliśmy mutację



Metoda nie jest prosta gdyż używamy mega starter



Problemem jest temperatura hybrydyzacji – jeden starter jest krótki a drugi jest
megaprimerem



Otrzymaną sekwencję zmutowaną można podmienić z sekwencją typu dzikiego w
wektorze(którego kopię sekwencji modyfikowano w PCR) ze 100% skutecznością



Kolejną zaletą jest to że potrzebujemy 3 a nie 4 starterów.