144

www.postepybiochemii.pl

Joanna Bem
Iwona Grabowska

*

Zakład Cytologii, Wydział Biologii, Uniwersy-

tet Warszawski, Warszawa

*

Zakład

Cytologii,

Wydział

Biologii,

Uniwersytet Warszawski, ul. Ilji Miecznikowa

1, 02-096 Warszawa; tel.: [phone], e-mail:

[e-mail]

Artykuł otrzymano 8 marca 2013 r.

Artykuł zaakceptowano 17 kwietnia 2013 r.

Słowa kluczowe: chromatyna, epigenetyka,

komórki ES, pluripotencja, samoodnawianie,

różnicowanie

Wykaz skrótów: CpG — dinukleotydy CG;

CT — obszar chromosomowy; komórki ES —

zarodkowe komórki macierzyste; komórki iPS

— indukowane komórki pluripotencjalne; PcG

— białka z grupy Polycomb; TrxG — białka z

grupy Trithorax

Podziękowania: Badania prowadzone przez

Autorów niniejszej pracy przeglądowej są

finansowane ze środków na naukę przyzna-

nych przez MNiSW grant nr: N N303 548139

oraz NCN grant nr: 2012/05/B/NZ1/00024.

Szczególne podziękowania kierujemy do Ma-

rii Anny Ciemerych-Litwinienko za wsparcie

i cenne wskazówki podczas redagowania ma-

nuskryptu.

Alchemia epigenetycznej regulacji pluripotencji

STRESZCZENIE

Z

arodkowe komórki macierzyste (komórki ES) charakteryzują się zdolnością do samo-

odnawiania swojej populacji oraz pluripotencją, czyli możliwością różnicowania we

wszystkie tkanki budujące dorosły organizm. W odpowiednich warunkach hodowli ko-

mórki te pozostają niezróżnicowane. Możliwe jest to dzięki aktywności czynników trans-

krypcyjnych, takich jak Sox2, Nanog, Klf4, Oct4, które odpowiedzialne są za utrzymanie

pluripotencji. Za unikalne cechy komórek ES odpowiadają również mechanizmy epigene-

tyczne, które regulują także funkcjonowanie zróżnicowanych komórek budujących tkanki.

Modyfikacje te umożliwiają zarówno intensywną proliferację, jak i zachowanie pluripoten-

cji, a więc utrzymanie komórek ES w stanie ciągłej gotowości do różnicowania. W tej pracy

przeglądowej przedstawione zostały takie mechanizmy epigenetyczne jak metylacja DNA,

potranslacyjne modyfikacje histonów, remodeling chromatyny zależny od ATP oraz oddzia-

ływania z miRNA. Omówiono te procesy, które mają wpływ na pluripotencję i samoodna-

wianie mysich oraz ludzkich komórek ES.

WPROWADZENIE

Określenie „epigenetyka” zostało po raz pierwszy zastosowane w 1942 roku

przez Waddingtona, który nazwał w ten sposób procesy pozwalające na powsta-

nie różnych fenotypów komórek pomimo tej samej sekwencji DNA [1]. W la-

tach 90-tych definicja ta została zawężona do modyfikacji w obrębie chromatyny

(Ryc. 1), które regulują czas i miejsce ekspresji genów, i które są przekazywane

komórce potomnej [2]. Modyfikacje epigenetyczne mogą podlegać dziedzicze-

niu, nie są jednak związane ze zmianą sekwencji DNA. Zalicza się do nich m.in.

metylację DNA, kowalencyjne modyfikacje histonów oraz zależną od ATP prze-

budowę (ang. remodeling) chromatyny [3]. Modyfikacje epigenetyczne stanowią

„ślad”, który podlegając dziedziczeniu warunkuje tzw. „pamięć komórkową”

oraz zachowanie tożsamości przez komórki zarówno w trakcie rozwoju zarod-

kowego jak i w tkankach dorosłego organizmu. Regulacja epigenetyczna odgry-

wa rolę w procesach takich jak: różnicowanie, rozwój zarodkowy, transformacja

nowotworowa, czy odpowiedź komórek na stres [4-7].

Niezwykle istotny

wpływ regulacji epi-

genetycznej na losy

komórek widoczny

jest w trakcie roz-

woju zarodkowego

ssaków. Z zygoty,

na skutek podziałów

powstają komórki,

dające początek list-

kom zarodkowym

ekto-, endo- i me-

zodermie, których

dalsze różnicowanie

umożliwia wykształ-

cenie tkanek dorosłe-

go organizmu. DNA

zygoty oraz wyspe-

cjalizowanych komó-

rek tworzących tkan-

ki ma identyczną

sekwencję, a ogrom-

na różnorodność ko-

mórek budujących

dorosły

organizm

Postępy Biochemii 59 (2) 2013

145

możliwa jest właśnie dzięki modyfikacjom epigenetycz-

nym, które modulują ekspresję genów kodujących zarówno

białka jak i regulatorowe RNA.

Zarodkowe komórki macierzyste (komórki ES, ang.

embryonic stem cells), uzyskiwane są z przedimplanta-

cyjnych zarodków ssaków, np. z węzłów zarodkowych

blastocyst. Unikalne cechy tych komórek sprawiają, że

są one doskonałym modelem do badania procesów za-

chodzących podczas różnicowania. Komórki ES mogą

różnicować we wszystkie rodzaje komórek budujących

dorosły organizm, cecha ta jest zwana pluripotencją.

Ponadto, liczba podziałów, jakie mogą przejść komórki

ES jest nieograniczona. Oznacza to, że komórki te są w

stanie odnawiać swoją populację niemal w nieskończo-

ność. W związku z tym, przy zachowaniu odpowiednich

warunków w trakcie hodowli in vitro (np. w przypadku

mysich komórek ES konieczna jest obecność czynnika LIF

w pożywce), populacja niezróżnicowanych komórek ES

nie ulega wyczerpaniu. Kolejną cechą komórek ES są nie-

zwykle krótkie cykle komórkowe (Ryc. 2) [8,9].

Komórki ES są utrzymywane w stanie niezróżnico-

wanym dzięki aktywności czynników transkrypcyjnych,

takich jak Nanog, Oct4, czy Sox2. Czynniki te regulują

ekspresję wielu genów, także tych kodujących enzymy

warunkujące modyfikacje epigenetyczne. Wpływają w

ten sposób na proliferację i hamują różnicowanie. Pod-

czas powstawania wyspecjalizowanych komórek poziom

czynników odpowiedzialnych za utrzymanie pluripo-

tencji ulega obniżeniu. Tempo proliferacji różnicujących

komórek zmienia się, inicjowana jest również ekspresja

genów odpowiedzialnych za powstawanie określonych

tkanek. Jednak od wielu lat wiadomo, że zmiany te są

odwracalne. Dowiodły tego zarówno doświadczenia, w

których dokonywano transferu jądra komórkowego uzy-

skanego z komórki somatycznej do oocytu pozbawionego

materiału genetycznego, fuzja komórek pluripotencjal-

nych z komórkami somatycznymi skutkująca powsta-

niem hybryd komórkowych [10] jak i uzyskanie induko-

wanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ko-

mórki iPS, ang. induced pluripotent stem cells). Tak więc,

zróżnicowane komórki mogą zostać reprogramowane i

„osiągnąć” stan niezróżnicowany [11]. Analiza pluripo-

tencjalnych komórek ES oraz iPS umożliwia poznanie

mechanizmów odpowiedzialnych za rozwój zarodków,

różnicowanie komórek a także utrzymanie pluripotencji

i niezróżnicowanego stanu komórek macierzystych. Jed-

nym z istotnych wątków tych badań jest poznanie roli

modyfikacji epigenetycznych w tych procesach.

ARCHITEKTURA JĄDRA ORAZ STRUKTURA

CHROMATYNY A LOSY KOMÓREK

Lokalizacja DNA w obrębie jądra komórkowego jest

nieprzypadkowa i wpływa na ekspresję genów. Każdy

chromosom zajmuje określony obszar w obrębie jądra ko-

mórkowego (CT, ang. chromosome territory) [12]. Rejony

aktywne transkrypcyjnie znajdują się obok siebie umożli-

wiając jednoczesną ekspresję genów zlokalizowanych na

różnych chromosomach. Ponadto, uważa się, że w jądrze

komórkowym rejony aktywne transkrypcyjnie położone

są centralnie, natomiast peryferycznie ułożone fragmenty

DNA mogą charakteryzować się niską aktywnością trans-

krypcyjną. W przypadku mysich komórek ES peryferycz-

ne położenie genów w jądrach nie ma tak hamującego

wpływu na ich ekspresję jak dzieje się to w przypadku

komórek zróżnicowanych np. fibroblastów [13]. Wiado-

mo również, że przesunięcie obszaru DNA zawierającego

dany gen poza obszar CT może prowadzić do jego zwięk-

szonej ekspresji [12,14,15]. Analizy ludzkich komórek

wykazały, że położenie wielu CT zarówno w komórkach

ES jak i komórkach somatycznych jest podobne [16,17].

Jednak położenie genów kodujących białka kluczowe dla

funkcjonowania komórek ES jest inne niż w jądrach ko-

mórek somatycznych. Na przykład, obszar chromosomu

12, w którym znajduje się gen kodujący białko Nanog jest

zlokalizowany bardziej centralnie w jądrach komórek ES

niż w jądrach ludzkich fibroblastów [16]. Położenie genu

POU5F1 kodującego białko Oct4 względem środka jądra

komórkowego jest takie samo w komórkach ES jak i w

komórkach somatycznych. Jednak w komórkach ES gen

ten jest zlokalizowany poza obszarem CT charaktery-

stycznym dla komórek zróżnicowanych. Wiąże się to z

wysoką aktywnością transkrypcyjną tego genu [16]. Tak

więc, umiejscowienie genów kluczowych dla utrzymania

niezróżnicowanego stanu w komórkach ES jest inne niż w

komórkach zróżnicowanych. Umożliwia to wysoką eks-

146

www.postepybiochemii.pl

presję tych genów, a tym samym warunkuje zachowanie

pluripotencji. Wykazano, że podczas różnicowania ludz-

kich komórek ES położenie genów NANOG oraz POU5F1

zmienia się: fragment DNA zawierający NANOG zajmuje

bardziej peryferyczną pozycję w jądrze komórkowym.

Gen POU5F1 lokalizuje się natomiast w swoim obszarze

CT charakterystycznym dla komórek zróżnicowanych

[16,17].

Nie należy także pomijać faktu, że rozluźnienie struk-

tury chromatyny ułatwia replikację materiału genetycz-

nego, a co za tym idzie ma wpływ na proliferację komó-

rek [18,19]. Uważa się, że na przebieg proliferacji komó-

rek ES wpływa także umiejscowienie obszarów centro-

merowych, łączących ze sobą chromatydy siostrzane. W

jądrach komórek ES obszary te są zlokalizowane bardziej

centralnie niż w komórkach zróżnicowanych, co prawdo-

podobnie jest korzystne w komórkach, które intensywnie

się dzielą. Podczas różnicowania obszary centromero-

we przemieszczają się na peryferie jądra komórkowego

[16,20]. Różnice między komórkami zróżnicowanymi, a

pluripotencjalnymi komórkami ES manifestują się także

na poziomie przedziałów jądra komórkowego. W jądrze

komórkowym większości komórek znajdują się wyspecja-

lizowane obszary, takie jak jąderko, ciałka PML (ang. pro-

myelocytic leukemia nuclear bodies), struktury SC-35 (zwane

także „splicing speckle”), oraz ciałka Cajala. Struktury te

zawierają białka oraz RNA, które pełnią funkcje regulują-

ce m.in. transkrypcję, splicing, potranslacyjne modyfika-

cje białek oraz ich degradację. W jądrach komórek ES ob-

serwuje się obecność tych samych ciałek, co w komórkach

somatycznych. Jednak w komórkach pluripotencjalnych

mogą one mieć inny skład lub morfologię. W komórkach

ES jąderko, zaangażowane w biogenezę rRNA, obfituje

w nukleosteminę, GTPazę regulującą aktywność białka

p53, które jest czynnikiem transkrypcyjnym uczestniczą-

cym w regulacji syntezy m.in. inhibitora cyklu komórko-

wego p21cip1 [21,22]. Nukleostemina pośrednio hamuje

aktywność p53, przez co zapobiega zahamowaniu cyklu

komórkowego. Wyciszenie ekspresji genu kodującego

nukleosteminę w komórkach ES hamuje zarówno ich

samoodnawianie jak i różnicowanie [21-23]. Natomiast

doprowadzając do nadekspresji genów kodujących nu-

kleosteminę, POU5F1 i SOX2, w ludzkich komórkach

nabłonka gruczołu mlekowego reprogramowano je w ko-

mórki iPS [22]. Struktury SC-35 to skupiska czynników

związanych z transkrypcją oraz dojrzewaniem mRNA. W

ich skład wchodzi m.in. SC35 (ang. splicing component, 35

kDa), białko biorące udział w powstawaniu spliceosomu

i w pierwszych etapach splicingu. W sąsiedztwie struk-

tur SC-35 lokalizują się geny aktywne transkrypcyjnie

[24]. W jądrach komórek somatycznych można zlokali-

zować od 10 do 50 wyraźnych struktur SC-35. W ludz-

kich komórkach ES białka SC35 są albo rozproszone w

nukleoplazmie nie tworząc charakterystycznych ciałek,

albo nie są wykrywane [20,25]. Indukcja różnicowania

komórek ES powoduje, że struktury SC-35 zaczynają się

wyodrębniać [20]. Butler i Lawrence sugerują, że SC-35 to

struktury regulujące ekspresję genów specyficznych dla

określonych rodzajów zróżnicowanych komórek, dlatego

w komórkach pluripotentnych nie są wykrywane [20].

W transkrypcję oraz w splicing zaangażowane są także

ciałka Cajala. Charakterystyczne są one zwłaszcza dla

komórek, których aktywność metaboliczna jest wysoka,

a więc np. dla neuronów czy komórek nowotworowych.

Jednak w ludzkich komórkach ES, nie zaobserwowa-

no ciałek Cajala. Koilina, białko charakterystyczne dla

tych ciałek jest obecne w jądrach komórek ES, pozosta-

je jednak rozproszone w nukleoplazmie. Podobnie jak w

przypadku SC-35, ciałka Cajala zaczynają być widoczne

dopiero w komórkach różnicujących [20]. Ciałka PML to

struktury biorące udział w wielu procesach, np. replikacji

i naprawie DNA, przebudowie chromatyny, transkryp-

cji. W komórkach somatycznych w skład ciałek wchodzą

takie białka jak Pml (ang. promyelocytic leukemia protein),

Sumo-1, Sp100, p53, pRB, HP1 oraz Daxx, które są m.in.

regulatorami transkrypcji. W komórkach tych obserwuje

się od 5 do 30 ciałek PML o charakterystycznym kolistym

bądź pierścieniowym kształcie [20,26]. Natomiast, ana-

lizy ludzkich komórek ES wykazały różnice zarówno w

składzie jak i morfologii ciałek PML w porównaniu do ko-

mórek somatycznych. W ludzkich komórkach ES ciałka te

są mniej liczne (1–3), większe, tworzą rozgałęzione rozety

lub długie pałeczki. Nie zawierają one Sumo-1, Sp100 czy

Daxx [20]. Znaczenie tych różnic nie zostało jednak jesz-

cze wyjaśnione. Pod wpływem czynników indukujących

różnicowanie komórek ES ciałka PML upodobniają się

do ciałek PML obecnych w jądrach komórek zróżnicowa-

nych [20].

Komórki ES charakteryzują dwie pozornie wykluczające

się cechy: zahamowanie ekspresji genów odpowiedzialnych

za różnicowanie, przy jednoczesnym utrzymaniu tych ge-

nów w stanie ciągłej „gotowości”, umożliwiającej natych-

miastowe niemal podjęcie różnicowania. Uważa się, że te

właściwości komórek ES wynikają z unikalnych cech ich

chromatyny. W komórce zróżnicowanej chromatyna obej-

mująca te geny, których ekspresja jest charakterystyczna

dla innych rodzajów komórek pozostaje skondensowana

w heterochromatynie. Natomiast cechą komórek ES jest

to, że w ich jadrze komórkowym dominuje euchromatyna

[27]. Prawdopodobnie to dlatego aktywność transkrypcyj-

na komórek ES jest znacząco wyższa niż komórek, które

nie są pluripotencjalne, np. neuronalnych czy hematopo-

etycznych komórek macierzystych [27,28]. W komórkach

ES ekspresji ulegają sekwencje nieaktywne transkrypcyjnie

w komórkach zróżnicowanych, takie jak np. satelitarne se-

kwencje powtórzone występujące w obszarach centromero-

wych, czy niektóre transpozony [27,29]. W komórkach ES

można także wykryć ekspresję, chociaż na bardzo niskim

poziomie, genów tkankowo specyficznych. Przykładowo,

wykrywano w nich transkrypty genu kodującego miogeni-

nę (MyoG), czyli czynnik transkrypcyjny charakterystyczny

dla mięśni szkieletowych, czy też genu Col1a1 (ang. collagen

type I alpha), kodującego charakterystyczny dla tkanki łącz-

nej kolagen I [27,28]. Wciąż nie jest jasne, czy niespecyficzna

ekspresja tak wielu genów jest konieczna dla prawidłowego

funkcjonowania komórek ES (np. umożliwiając produkcję

regulatorowych RNA), czy też jest tylko skutkiem ubocz-

nym rozluźnionej struktury chromatyny [27].

W komórkach ES niewiele jest obszarów heterochroma-

tyny, a ich pojawienie się jest związane z procesem różni-

cowania. Za utrzymanie heterochromatyny odpowiadają

Postępy Biochemii 59 (2) 2013

147

takie białka jak np. HP1 (ang. heterochromatin protein 1).

Białko to rozpoznaje modyfikacje histonów, takie jak mety-

lacja H1K26, lub metylacja H3K9, charakterystyczne dla ob-

szarów DNA o niskiej aktywności transkrypcyjnej [30,31].

Ponadto HP1 może oddziaływać z metylotransferazami

histonowymi, które katalizują powstawanie H3K9me, przy-

czyniając się w ten sposób do heterochromatynizacji [31].

W jądrach komórek ES białko HP1 przejściowo oddziałuje z

chromatyną, w związku z tym większość białka jest rozpro-

szona w nukleoplazmie [14,32]. Prawdopodobnie pula biał-

ka HP1, która pozostaje niezwiązana z chromatyną umoż-

liwia szybką heterochromatynizację towarzyszącą różnico-

waniu komórek ES. Jest to dowód na to, że w jądrach ko-

mórek ES obecne są czynniki warunkujące „gotowość” do

różnicowania.

METYLACJA DNA

Metylacja cytozyny jest powszechnie występującą mody-

fikacją DNA. Polega ona na przyłączeniu reszty metylowej

w pozycji 5 pierścienia pirymidynowego cytozyny i najczę-

ściej zachodzi w obrębie powtórzeń dinukleotydów C-G

(CpG). W komórkach somatycznych ok. 70-80% wszystkich

dinukleotydów CpG ulega metylacji [18]. Metylacja DNA

katalizowana jest przez metylotransferazy DNA — Dnmt

(ang. DNA methyltransferase). W genomie ssaków zidenty-

fikowano cztery geny kodujące te enzymy (Dnmt1, Dnmt2,

Dnmt3a, Dnmt3b). Spośród nich Dnmt3a i Dnmt3b mody-

fikują DNA de novo, Dnmt1 utrzymuje prawidłową mety-

lację genomu po jego replikacji, natomiast Dnmt2 metyluje

tRNA, przez co stabilizuje te cząsteczki i promuje translację

[33-36].

Metylacja sekwencji kodującej lub promotora genu ha-

muje jego ekspresję [37-39], np. blokując rozpoznanie se-

kwencji docelowych przez czynniki transkrypcyjne [40-42].

Ponadto ze zmetylowanymi cytozynami specyficznie wiążą

się białka z grupy MBD (ang. methyl binding domain), które

oddziałują z deacetylazami histonów, enzymami które usu-

wają acetylowane reszty z N terminalnych końców histo-

nów [43-45]. Przykładowo białko Mbd1 wraz z Hdac3 (ang.

histone deacethylase 3) lokalizując się w obszarze promoto-

rowym przyczyniają się do heterochromatynizacji i wyci-

szenia ekspresji genu [44]. MBD, mogą także oddziaływać

z innymi białkami uczestniczącymi w heterochromatyniza-

cji, jak HP1, czy z metylotransferazą lizyny 9 histonu H3 -

Suv39h1 [46]. Mogą także wraz z deacetylazami histonowy-

mi oraz białkami z grupy CHD (ang. chromodomain helicase

DNA-binding) wchodzić w skład kompleksu NURD, który

hamuje ekspresję genów poprzez zwiększenie upakowania

nukleosomów [47,48]. Analizy myszy pozbawionych ge-

nów kodujących metylotransferazy DNA wykazały, że en-

zymy te są kluczowe dla rozwoju zarodkowego i funkcjono-

wania wielu tkanek. Mutacje w genach kodujących Dnmt1

i Dnmt3b są letalne na postimplantacyjnych stadiach roz-

woju zarodkowego. W przypadku utraty funkcji Dnmt3a

myszy rodzą się, ale przeżywają jedynie około 4 tygodnie

[33,49]. Wiadomo, że w przedimplantacyjnych zarodkach

myszy poziom metylacji genów jest niższy w porównaniu

do komórek organizmów dorosłych. Na tym etapie rozwoju

usuwane są reszty metylowe, a globalna demetylacja DNA

umożliwia ekspresję genów kluczowych dla pluripotencji.

Następnie, jeszcze przed implantacją zarodka dochodzi do

ponownej metylacji DNA. Niektóre allele są metylowane w

zależności od tego, czy pochodzą od organizmu matczyne-

go czy ojcowskiego, mechanizm ten zwany imprintingiem

umożliwia prawidłowy rozwój zarodkowy [38,50,51]. Co

ciekawe, choć komórki ES uzyskiwane są z przedimplanta-

cyjnego zarodka, którego genom uległ demetylacji, genom

komórek ES jest zmetylowany, co dowodzi że demetylacja

DNA nie jest niezbędnym warunkiem do utrzymania stanu

pluripotencji [33]. Dodatkowo, cechą komórek ES jest pra-

wie czterokrotnie wyższy poziom metylacji poza dinukle-

otydami CpG w stosunku do komórek budujących tkanki

[52], jednak znaczenie funkcjonalne tej różnicy nie zostało

jeszcze zbadane. Podczas różnicowania metylacja w obsza-

rach ubogich w CpG zanika. W komórkach ES geny odpo-

wiedzialne za utrzymanie pluripotencji nie są metylowane,

natomiast podczas różnicowania geny kodujące markery

pluripotencji Nanog i Oct4 ulegają metylacji, co blokuje ich

ekspresję i umożliwia różnicowanie [50,53,54].

Komórki ES pozbawione funkcjonalnego genu kodują-

cego metylotransferazę Dnmt1, lub Dnmt3a, lub Dnmt3b,

jak i komórki jednocześnie pozbawione wszystkich tych ge-

nów, proliferują i pozostają niezróżnicowane [33,49,54,55].

Jednak w warunkach indukujących różnicowanie komórki

te inicjują apoptozę [49,56]. Dane te wskazują, że metyla-

cja DNA nie jest niezbędna do zachowania pluripotencji i

samoodnawiania populacji komórek ES. Jest natomiast klu-

czowa podczas różnicowania. Hipometylacja spowodowa-

na brakiem obu metylotransferaz Dnmt3a, Dnmt3b zaburza

różnicowanie komórek ES uniemożliwiając hamowanie

ekspresji genów związanych z pluripotencją, kodujących

Nanog i Oct4 [53].

MODYFIKACJE HISTONÓW

Potranslacyjne modyfikacje histonów stanowią kolej-

ny „element” epigenetycznej regulacji ekspresji genów.

Aminokwasy znajdujące się na N końcach histonów pod-

legają modyfikacjom, takim jak m.in. acetylacja, metyla-

cja, fosforylacja, ADP-rybozylacja, ubikwitylacja, czy su-

moilacja. Modyfikacje te mogą bezpośrednio wpływać na

strukturę chromatyny, np. acetylacja lizyn neutralizuje

dodatni ładunek histonów, co zmniejsza ich powinowac-

two do DNA [57,58]. Zmodyfikowane reszty aminokwa-

sów mogą być także rozpoznawane przez inne białka.

Na przykład, kompleksy remodelujące chromatynę typu

SWI/SNF, dzięki obecności bromodomeny rozpoznają

acetylowane lizyny na N końcach histonów, następnie

przesuwają nukleosomy, rozluźniając bądź zwiększając

upakowanie struktury chromatyny. W związku ze swoimi

właściwościami, niektóre modyfikacje, jak np. acetylacja

lizyn (np. H3K9ac) lub trimetylacja lizyny 4 histonu H3

(H3K4me3) uznawane są za aktywatory ekspresji genów.

Z kolei metylacja lizyny 27 histonu H3 (H3K27me2/3),

katalizowana przez kompleks Polycomb, lub metylacja

lizyny 9 histonu H3 (H3K9me), hamują ekspresję ge-

nów. Część badaczy uważa, że modyfikacje tworzą ro-

dzaj „kodu histonowego”, którego zrozumienie pozwoli

na odszyfrowanie wzoru ekspresji genów. Jednakże ów

„kod” nie jest jednoznaczny i nie należy tego określenia

rozumieć w sposób dosłowny. Wiele modyfikacji może

148

www.postepybiochemii.pl

być bowiem wynikiem, a nie powodem zmian ekspresji

genów [59]. Potranslacyjne modyfikacje histonów regulu-

ją wiele procesów zachodzących w obrębie chromatyny,

także replikację oraz naprawę DNA [58].

Wiele enzymów modyfikujących histony jest niezbęd-

nych dla prawidłowego przebiegu rozwoju zarodkowego

ssaków. Mutacje w genach Ash2l (ang. absent, small, or ho-

meotic, Drosophila, homolog 2-like) lub Ezh2 (ang. enhancer

of zeste) kodujących metylotransferazy histonów, prowa-

dzą do śmierci zarodka myszy [60,61]. Natomiast niepra-

widłowa synteza enzymów modyfikujących histony w

komórkach dorosłych organizmów może się przyczyniać

do transformacji nowotworowej [62]. Zarówno ludzkie

jak i mysie komórki ES odróżniają się od komórek róż-

nicujących bądź zróżnicowanych charakterystycznym

wzorem modyfikacji histonów. W komórkach ES histo-

ny związane z DNA w obszarach promotorowych bądź

w okolicach startu transkrypcji wykazują bardzo wysoki

poziom acetylacji. Acetylacja lizyny 9 histonu H3 (H3K9)

wykrywana jest w obszarze promotorów m.in. Nanog,

Pou5f1, oraz cMyc [63-65]. Podczas różnicowania mysich

komórek ES następuje deacetylacja H3K9, z czym wiąże

się spadek ekspresji tych genów [17,64]. Indukcja różni-

cowania komórek ES, powoduje globalny spadek acety-

lacji histonów [65].

Analizy mysich oraz ludzkich komórek ES wskazują,

że na wielu sekwencjach promotorowych mogą jedno-

cześnie znajdować się histony podlegające przeciwstaw-

nym modyfikacjom. Są to: hamująca ekspresję metylacja

lizyny 27 histonu H3 (H3K27me2/3) oraz aktywująca

ekspresję trimetylacja lizyny 4 histonu H3 (H3K4me3).

Obszary chromatyny, w których znajdują się takie „dwu-

znaczne” modyfikacje zwane są domenami biwalentnymi

[63,66,67]. Analizy modyfikacji histonów w ludzkich ko-

mórkach ES wykazały, że geny regulowane jedynie dzięki

trimetylacji lizyny 4 histonu H3 (H3K4me3) są odpowie-

dzialne przede wszystkim za syntezę i metabolizm białek

oraz regulację cyklu komórkowego. Z kolei występowa-

nie histonów zmodyfikowanych biwalentnie (H3K4me3

oraz H3K27me3) wykazano na wielu promotorach ge-

nów związanych z różnicowaniem [67]. O ile większość

genów, w obrębie których lokalizuje się H3K4me3 ulega

transkrypcji, to geny których ekspresja regulowana jest

przez biwalentne modyfikacje histonu H3 są w większo-

ści nieaktywne transkrypcyjnie [66,67]. W chromatynie

komórek różnicujących lub zróżnicowanych, np. w neu-

ronalnych komórkach progenitorowych, mioblastach,

bądź fibroblastach obserwuje się niewielką liczbę domen

biwalentnych, stąd wniosek że domeny takie charaktery-

zują komórki pluripotentne [66,67]. Uważa się, że dzięki

obecności domen biwalentnych, możliwe jest wyciszenie

ekspresji genów kluczowych dla różnicowania. Jedno-

cześnie dzięki obecności modyfikacji H3K4me3, możliwa

jest, w odpowiedzi na sygnały indukujące różnicowanie,

szybka ekspresja genów regulujących te procesy. Znacze-

nie domen biwalentych nie zostało jeszcze potwierdzone

w rozwoju zarodkowym ssaków. Ich obecność udoku-

mentowano w zarodkach Danio rerio [68], jednak w chro-

matynie zarodków Xenopus oraz Drosophila takie domeny

nie występują [69,70].

BIAŁKA Z GRUP TRITHORAX ORAZ POLYCOMB

Nukleosomy umożliwiają ścisłe upakowanie DNA w

jądrze. Stanowią jednak fizyczną barierę dla czynników

transkrypcyjnych oraz elementów regulatorowych. Jednym

z czynników regulujących dostępność DNA dla białek re-

gulatorowych oraz RNA są wielobiałkowe kompleksy re-

modelujące chromatynę. Są one odpowiedzialne między

innymi za przesuwanie nukleosomów oraz potranslacyjne

modyfikacje histonów, które skutkują zmianami w konden-

sacji chromatyny. Zarówno skład jak i aktywność komplek-

sów zmieniają się trakcie rozwoju zarodkowego ssaków.

Kompleksy remodelujące chromatynę pełnią kluczową rolę

w pluripotencji oraz różnicowaniu [71,72].

Wśród białek modulujących strukturę chromatyny wy-

różnia się dwie, często przeciwstawnie działające grupy:

Trithorax oraz Polycomb. Białka obu rodzin zostały po raz

pierwszy opisane na przełomie lat 70- i 80-tych, jako regu-

latory rozwoju D. melanogaster. Mutacje w genach kodują-

cych te białka znacząco wpływały na rozwój larwalny lub

też były letalne. Białka Trithorax warunkują prawidłowy

rozwoju segmentów głowy, tułowia oraz odwłoka D. me-

lanogaster, natomiast białka Polycomb uczestniczą w ustale-

niu symetrii grzbietowobrzusznej [73,74]. Obie grupy białek

regulują ekspresję genów Hox (ang. homeobox), kodujących

kluczowe dla rozwoju zarodkowego zwierząt czynniki

transkrypcyjne, z rodzin takich jak Pax, Pou, Dlx, Irx, Lhx,

Six oraz czynniki z rodzin Gata, Sox, Fox [75]. Wszystkie te

geny kodują nadrzędne regulatory sieci transkrypcyjnych

regulujących rozwój zarodkowy. Białka Polycomb są znane

głównie jako represory ekspresji genów, natomiast białka

Trithorax jako aktywatory [74].

BIAŁKA Z GRUPY TRITHORAX

Do rodziny Trithorax (TrxG, ang. trithorax group) należą

m.in. białka wykorzystujące energię z hydrolizy ATP do

przemieszczania nukleosomów względem nici DNA. Prze-

sunięcie nukleosomów może spowodować odsłonięcie pro-

motora oraz sekwencji regulatorowych, udostępnienie ich

czynnikom transkrypcyjnym i zainicjowanie transkrypcji.

Przemieszczenie nukleosomów może także przyczynić się

do silniejszego upakowania nukleosomów i w efekcie zaha-

mować ekspresję [3]. Uważa się, że sekwencje umożliwiają-

ce rozpoczęcie transkrypcji genów tkankowo specyficznych

znajdują się w obrębie nukleosomu, a ich ekspresja wymaga

aktywności kompleksów remodelujących chromatynę. W

regulacji dostępności tych sekwencji uczestniczą komplek-

sy remodelujące, w skład których wchodzą niektóre białka

TrxG [3,76]. Białka TrxG tworzą wieloskładnikowe kom-

pleksy, które w zależności od rodzaju obecnej w kompleksie

ATPazy dzieli się na kompleksy typu SWI/SNF (ang. mate

type switching/sucrose non fermentable), CHD (ang. chromodo-

main helicase DNA-binding), INO80 oraz ISWI (ang. imitation

switch) [71,77,78]. Najlepiej zbadanymi kompleksami z ro-

dziny trxG są SWI/SNF, u ssaków należą do nich komplek-

sy BAF (ang. Brg1 associated factor) oraz P-BAF (ang. Polybro-

mo - and BAF containing). W skład obu kompleksów wcho-

dzą m.in. ATPaza Brm lub Brg1 (ang. Brahma related gene 1),

białka wiążące DNA takie jak Baf250 (ang. Brg1 associated

factor) oraz białka umożliwiające oddziaływanie z innymi

Postępy Biochemii 59 (2) 2013

149

podjednostkami np. Baf155 lub Baf170 [76]. Białkami spe-

cyficznymi dla kompleksów BAF są Baf250a oraz Baf250b,

natomiast białka Baf180 i Baf200 są charakterystyczne dla

składu P-BAF [76]. Kompleksy SWI/SNF różnią się skła-

dem w zależności od rodzaju komórki. Obecnie wiadomo,

że w jednej komórce może występować wiele wariantów

BAF oraz P-BAF. Ich skład zmienia się pod wpływem lokal-

nych oddziaływań z czynnikami transkrypcyjnymi [76,79].

Znaczenie kompleksów SWI/SNF w rozwoju oraz róż-

nicowaniu zostało potwierdzone u wszystkich organizmów

wyższych, zarówno u roślin jak i u zwierząt. Badania doty-

czące roli kompleksów SWI/SNF w rozwoju zarodkowym

myszy udokumentowały rolę ich niektórych podjednostek.

U myszy delecje genów kodujących Brg1, Snf5 oraz Baf155/

Srg3 są letalne już na stadium blastocysty, a więc przed im-

plantacją, natomiast zarodki pozbawione Baf250a umierają

podczas gastrulacji [80-82]. Mutacje w genach kodujących

inne podjednostki, jak np. Brm, nie mają wpływu na rozwój

zarodkowy myszy [80]. Badania składu kompleksów SWI/

SNF w mysich komórkach ES (tzw. esBAF, ang. embryonic

stem BAF), wykazały że jest on podobny do składu komplek-

sów wykrywanych na wczesnych etapach rozwoju zarod-

kowego. Analiza z zastosowaniem ChIP-seq oraz ChIP-chip

wykonana dla ATPazy BRG1 oraz białka BAF155 wskazała,

że w mysich komórkach ES kompleks esBAF oddziałuje z

jedną czwartą promotorów wszystkich genów. Obecność

tego kompleksu koreluje ponadto z wysoką ekspresją ge-

nów docelowych: kodujących białka pozytywnie regulują-

ce cykl komórkowy, odpowiadających za zachowanie plu-

ripotencji oraz samoodnawianie komórek ES. Wśród nich

znalazły się geny kodujące Oct4, Sox2, Nanog, Sall4, Rest,

Dppa2, Dppa4, a także geny z rodziny Polycomb [83,84]. Na

promotorach wielu genów kompleks esBAF kolokalizuje z

czynnikami transkrypcyjnymi Oct4, Sox2, Nanog, STAT3,

oraz SMAD1, a z niektórymi bezpośrednio oddziałuje, co

sugeruje jego zaangażowanie w utrzymanie pluripotencji

i samoodnawianie [83,84]. Co ciekawe, esBAF wykrywa-

ny był także na promotorach genów o niskiej aktywności

transkrypcyjnej, charakterystycznych dla komórek zróż-

nicowanych [85]. Znaczącą rolę esBAF w pluripotencji po-

twierdzono w doświadczeniu, w którym reprogramowano

komórki somatyczne uzyskując komórki iPS poprzez rów-

noczesną nadprodukcję Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Brg1 oraz

Baf155 [86]. Zabieg taki znacząco zwiększył efektywność re-

programowania. Wykorzystanie esBAF pozwoliło także na

pominięcie onkogenu c-Myc [86]. Podczas różnicowania ko-

mórek ES synteza podjednostek BAF180 oraz BAF200, które

wchodzą w skład kompleksu P-BAF, rośnie. P-BAF bierze

udział w heterochromatynizacji promotorów genów kodu-

jących Oct4 oraz Nanog, przyczynia się także do powstania

charakterystycznych dla komórek zróżnicowanych skupisk

heterochromatyny [87].

Oprócz wyżej opisanych kompleksów SWI/SNF do ro-

dziny białek Trithorax zaliczanych jest także dziewięć bia-

łek z grupy CHD (ang. chromodomain helicase DNA-binding).

Są to ATPazy zawierające chromodomenę. Niektóre białka

CHD mogą tworzyć kompleksy, jak dzieje się to w przypad-

ku Chd3 (tzw. Mi-2α) oraz Chd4 (tzw. Mi-2β), które wcho-

dzą w skład kompleksu NURD (ang. nucleosome remodeling

and histone deacetylation). Inne białka CHD, takie jak Chd1

działają jako monomery [48]. Badania charakteryzujące

Chd1 u drożdży, D. melanogaster oraz u ssaków, wskazują

że białko to aktywuje ekspresję genów poprzez rozluźnie-

nie struktury chromatyny. Za pomocą dwóch chromodo-

men ATPaza ta rozpoznaje H3K4me2/3, a więc modyfikacje

charakterystyczne dla rejonów DNA aktywnych transkryp-

cyjnie. Przyłączenie się Chd1 do tak zmodyfikowanych hi-

stonów zlokalizowanych w obszarach promotorowych po-

woduje dysocjację nukleosomów, co umożliwia rozpoczęcie

transkrypcji [88].

Rola Chd1 w rozwoju zarodkowym ssaków nie została

dotychczas poznana [48,88]. Wiadomo jednak, że białko to

jest jednym z głównych regulatorów „rozluźnionego” stanu

chromatyny w mysich komórkach ES. Wyciszenie ekspresji

genu kodującego Chd1 w tych komórkach powoduje glo-

balną heterochromatynizację powodującą m.in. obniżenie

ekspresji genu kodującego czynnik Oct4, co prowadzi do

spadku zdolności zarówno do samoodnawiania, jak i do

różnicowania tych komórek [89]. Zaburzenia organizacji

chromatyny spowodowane wyciszeniem ekspresji genu ko-

dującego Chd1 ograniczają różnicowanie tych komórek w

pierwotną endodermę. Ponadto ekspresja genu kodującego

Chd1 jest zależna m.in. od Oct4, Sox2 oraz Nanog. W mo-

mencie różnicowania i spadku ekspresji tych czynników,

zmniejsza się także poziom białka Chd1, co umożliwia hete-

rochromatynizację charakterystyczną dla komórek zróżni-

cowanych budujących tkanki [89].

Kompleks NURD działa przeciwstawnie do CHD1,

uczestniczy bowiem w hamowaniu ekspresji genów. U ssa-

ków w skład NURD oprócz Chd3 i Chd4 mogą wchodzić

białka MBD (Mbd2 i Mbd3) oraz deacetylazy histonowe

(Hdac1 i Hdac2). Prawdopodobnie ATPazy CHD przesu-

wając nukleosomy umożliwiają dostęp kompleksu NURD

do DNA. Białka MBD umożliwiają natomiast rekrutację

kompleksu NURD do zmetylowanego DNA [43,44]. Z

kolei deacetylazy histonowe usuwają acetylowane reszty

z lizyn histonów rdzeniowych, przez co przyczyniają się

do większego skondensowania nukleosomów i inhibicji

transkrypcji [48,57,58]. U myszy mutacja w genie kodują-

cym podjednostkę Mbd3, odpowiedzialną za formowanie

kompleksu NURD, jest letalna - zarodki obumierają wkrót-

ce po implantacji [47]. Podłoże obserwowanego fenotypu

może wiązać się z rolą Mbd3 w różnicowaniu komórek.

Mysie komórki ES pozbawione Mbd3 nie wykazują zabu-

rzeń samoodnawiania, jednak charakteryzują się obniżoną

zdolnością do różnicowania [90]. Sugeruje to, że NURD

nie jest niezbędny do inicjacji różnicowania, odpowiada

natomiast za dalsze etapy tego procesu. Mechanizm dzia-

łania kompleksu NURD w komórkach ES nie został do-

tychczas wyjaśniony. Wiadomo, że hamowanie ekspresji

genów przez NURD nie jest zjawiskiem tak globalnym jak

obserwowano to w przypadku aktywacji ekspresji przez

Chd1. Rolą kompleksu NURD jest zahamowanie ekspresji

genów odpowiedzialnych za pluripotencję, a tym samym

umożliwienie różnicowania [90]. Poszukiwanie bezpo-

średnich partnerów kompleksu NURD doprowadziło do

identyfikacji odziaływań między Chd4 i Hdac1, a takimi

białkami jak Nanog, Oct4, Sal4, Esrrb, czy c-Myc [91,92].

Jednak znaczenie tych oddziaływań w komórkach ssaków

wciąż nie jest znane.

150

www.postepybiochemii.pl

Innym kompleksem remodelującym chromatynę biorą-

cym udział w utrzymaniu samoodnawiania i pluripotencji,

zaliczanym do grupy INO80, jest Tip60-p400. W jego skład

wchodzą m.in. ATPaza p400, acetylotransferaza Tip60, oraz

białko Dmap1 (ang. Dnmt1 - associated protein). Mysie zarod-

ki pozbawione funkcjonalnego genu Tip60 lub genu Dmap1

umierają przed implantacją [93,94]. Wyciszenie za pomocą

siRNA ekspresji Dmap1 oraz Tip60 w komórkach ES, powo-

duje zaburzenia samoodnawiania oraz spadek pluripoten-

cji — komórki dzielą się wolniej, nie różnicują. Co ciekawe

komórki te eksprymują gen kodujący Oct4 oraz Nanog na

poziomie podobnym do kontrolnych komórek ES [93]. Ba-

dania te pokazały, że kompleks Tip60-p400 odpowiada za

hamowanie genów eksprymowanych podczas różnicowa-

nia takich jak Gata6 (ang. GATA binding protein 6) czy Snai1

(ang. snail homolog 1). Kompleks ten kolokalizuje ponadto z

czynnikiem transkrypcyjnym Nanog, z którym współdziała

w hamowaniu ekspresji genów związanych z różnicowa-

niem [93].

BIAŁKA Z GRUPY POLYCOMB

Białka Polycomb (PcG, ang. polycomb group) są uniwer-

salnymi represorami genów. U ssaków regulują m.in. róż-

nicowanie oraz „pamięć komórkową”, regulują także in-

aktywację chromosomu X [95-97]. Białka PcG tworzą dwa

rodzaje kompleksów zwane Polycomb Repressive Complex

1 oraz 2 (PRC1, PRC2). U ssaków PRC1 składa się z czte-

rech rdzeniowych podjednostek Ph, Pc, Psc, oraz dRing

[98]. Ostatnia z nich jest ligazą ubikwitynową typu E3, któ-

ra katalizuje monoubikwitylację lizyny 119 histonu H2A

(H2AK119u) [99]. Natomiast rdzeń kompleksu PRC2 two-

rzą białka Eed (ang. embryonic ectoderm development), Suz12

(ang. suppressor of zeste 12 protein homolog) oraz Ezh2. Ezh2

jest metylotransferazą katalizującą metylację lizyny 27 hi-

stonu 3 (H3K27me2/3), natomiast białka Eed oraz Suz12 są

potrzebne do aktywności Ezh2. Suz12 umożliwia oddziały-

wanie między Ezh2 i Eed, hamuje również degradacje Ezh2

w proteasomie 26S i jest ponadto niezbędne do aktywności

metylotransferazy Ezh2 [60,100,101].

Kompleks białek PcG, modyfikuje N końce histonów znaj-

dujące się w pobliżu genu docelowego, co zmienia strukturę

chromatyny i hamuje ekspresję danego obszaru DNA. PRC2

katalizuje di- lub trimetylację lizyny 27 histonu H3. Mody-

fikacja ta stanowi miejsce wiązania kompleksu PRC1, który

z kolei katalizuje ubikwitylację lizyny 119 histonu H2, a co

za tym idzie zwiększa upakowanie nukleosomów i powo-

duje dalszą heterochromatynizację [98,101,102]. Kompleksy

PRC1 wiążą się preferencyjnie z promotorami bogatymi w

CpG, z domenami biwalentnymi (H3K27me2/3, H3K4me3)

lub z trimetylowanymi H3K4me3 [98]. PRC2 zazwyczaj ini-

cjuje represję, natomiast PRC1 uczestniczy w jej stabilizacji.

Białka z rodziny Polycomb są niezbędne do prawidło-

wego rozwoju zarodków ssaków. Mutacje w genach Suz12,

Ezh2, lub Eed prowadzą do nieprawidłowego rozwoju i

śmierci mysich zarodków, a z blastocyst pozbawionych

Ezh2 nie udało się uzyskać komórek ES [60,100,101]. Muta-

cje w tych genach znacząco obniżają proliferację komórek

[101]. W mysich komórkach ES w skład kompleksu PRC2

wchodzą dodatkowo białka Pcl2 (ang. polycomb-like protein

2), oraz Jarid2 (ang. jumonji, AT rich interactive domain 2), któ-

re uczestniczą w rekrutacji oraz regulacji aktywności kom-

pleksu [103-106]. Brak kompleksu PRC2 w komórkach ES

powoduje przedwczesną ekspresję genów warunkujących

różnicowanie i zaburza pluripotencję, nie wpływa jednak

znacząco na ich samoodnawianie i podziały [98,107]. Jest to

o tyle zaskakujące, że analiza funkcji PRC1 wykazała udział

tego kompleksu w regulacji proliferacji. Wiadomo, że ha-

muje on bezpośrednio ekspresję genu kodującego cyklinę

D2, a więc czynnika aktywującego kluczowe dla inicjacji

fazy G1 kinazy CDK4/6 (ang. Cyclin dependent kinase 4/6),

oraz hamuje ekspresję genu inhibitora kinaz CDK - p57kip2

oraz Gadd45g (ang. growth arrest and DNA-damage-inducible,

gamma) [98].

Analizy mysich komórek ES wykazały, że białka kom-

pleksów PRC1 oraz PRC2 występują w obszarach DNA, w

których zlokalizowanych jest ponad 500 genów kodujących

m.in. czynniki transkrypcyjne oraz regulatory różnicowania

i rozwoju zarodkowego, takie jak np. geny Hox [75]. Dzięki

temu, że hamowanie ekspresji genów utrzymywana przez

kompleksy PRC jest odwracalna, podczas różnicowania

może zajść ich ekspresja [75,98]. W mysich oraz ludzkich

komórkach ES kompleksy PRC1 oraz PRC2 współdziałają z

czynnikami odpowiedzialnymi za utrzymanie pluripoten-

cji. PRC1 współwystępuje z czynnikami Oct4 oraz Nanog,

a PRC2 znajdowany jest na promotorach wraz z Oct4, Sox2

i Nanog [98,107]. Pod nieobecność PRC1, czynniki Nanog

oraz Oct4 nie są w stanie hamować ekspresji genów kodu-

jących czynniki warunkujące różnicowanie, takie jak Gata3,

Eif4g3, Bmp7, Bmi1, czy Gadd45g [98]. Ponadto Walker i jej

współpracownicy wykazali, że kompleks PRC2 uczestniczy

w regulacji ekspresji genów Pou5f1, Sox2, oraz Nanog. PRC2

metyluje, bowiem lizynę 27 histonu H3 (H3K27) lokalizują-

cego się na promotorach genów Klf4, Tbx3, Foxd3. Produkty

tych genów to czynniki aktywujące ekspresję Sox2, Nanog

oraz Oct4. Z tego powodu wyciszenie ekspresji podjedno-

stek PRC2 w komórkach ES powoduje obniżenie ich zdol-

ności do różnicowania [106]. Dodatkowo, ekspresja pod-

jednostek kompleksu PRC2 jest regulowana przez czynniki

Oct4, Sox2, Nanog, co jest kolejnym dowodem na istnienie

sprzężenia zwrotnego regulującego poziom czynników plu-

ripotencji [104,106].

Kompleksy PRC pełnią dwie z pozoru przeciwstawne

funkcje: hamując geny różnicowania utrzymują stan pluri-

potentny, oraz hamując aktywatory pluripotencji takie jak

Sox2, Nanog czy Oct4 umożliwiają różnicowanie. Wciąż

nie jest pewne co jest czynnikiem „przełączającym” między

stanem pluripotentnym, a inicjacją różnicowania, wiadomo

natomiast że kompleksy PRC pełnią kluczową funkcję w

utrzymaniu kruchej równowagi między tymi stanami, oraz

są niezbędne do “podjęcia decyzji” dotyczącej różnicowa-

nia.

MIKRORNA W ZARODKOWYCH

KOMÓRKACH MACIERZYSTYCH

MikroRNA wpływają na ekspresję wielu genów kodują-

cych regulatory epigenetyczne w tym m.in. metylotransfe-

razy DNA, acetylazy histonów oraz białka Polycomb. Także

Postępy Biochemii 59 (2) 2013

151

ekspresja samych mikroRNA podlega regulacji epigenetycz-

nej [108]. W związku z tym mikroRNA bywają zaliczane do

czynników uczestniczących w regulacji epigenetycznej.

MikroRNA to krótkie (21-25 pz), jednoniciowe cząsteczki

regulujące stabilność oraz translację mRNA. Obecnie wia-

domo, że cząsteczki te regulują ekspresję białek kontrolu-

jących wszystkie procesy zachodzące w komórce, w tym

także różnicowanie komórek towarzyszące rozwojowi za-

rodkowemu. Powstawanie mikroRNA (miRNA) zachodzi

wieloetapowo [109,110]. W wyniku transkrypcji genów ko-

dujących mikroRNA powstają pierwotne transkrypty tzw.

pri-mikroRNA (ang. primary microRNA). Pri-mikroRNA są

cięte przez kompleks białek zwanych Microprocesorem,

w którego skład wchodzą m.in. Dgcr8 (ang. DiGeorge syn-

drome critical region gene 8) oraz RNAza typu III - Drosha. W

wyniku cięcia powstaje pre-mikroRNA. Początkowe etapy

obróbki prekursorów mikroRNA odbywają się w jądrze ko-

mórkowym, pre-mikroRNA jest następnie transportowany

przy udziale Eksportyny 5 do cytoplazmy, gdzie w wyniku

cięcia kolejną nukleazą Dicer, powstaje dwuniciowa czą-

steczka. Jedna z nici dupleksu jest dojrzałym mikroRNA. To

ona stworzy kompleks z białkiem z rodziny Ago, druga z

nici najczęściej ulega degradacji [110]. MikroRNA uczestni-

czą w potranskrypcyjnym wyciszaniu genów, oddziałując

z komplementarnymi fragmentami 3’ mRNA (3’ UTR, ang.

untranslated region). Miejscem oddziaływania jest tzw. se-

kwencja „seed”, która znajduje się na 5’ końcu mikroRNA.

Związanie mikroRNA z transkryptem może prowadzić do

zahamowania translacji, bądź do degradacji mRNA [110].

Jedno mikroRNA może regulować wiele transkryptów do-

celowych a jeden transkrypt może być celem wielu różnych

mikroRNA. Znane są mikroRNA charakterystyczne zarów-

no dla komórek niezróżnicowanych np. blastomerów w

przedimplantacyjnym zarodku ssaka, komórek ES, komó-

rek podejmujących różnicowanie i tych skrajnie wyspecjali-

zowanych [111-113].

Dostępnych jest wiele dowodów na udział mikroRNA w

regulacji pluripotencji oraz samoodnawiania. Wielu z nich

dostarczyły analizy komórek ES pozbawionych funkcjonal-

nych genów kodujących enzymy niezbędne do biogenezy

mikroRNA. Mutacje w genach kodujących zarówno Dicer,

Dgcr8, jak i Drosha powodowały zaburzenia samoodnawia-

nia mysich oraz ludzkich komórek ES. Wstrzymanie synte-

zy mikroRNA powodowało zahamowanie podziałów tych

komórek [114-117].

Analizy ekspresji mikroRNA w komórkach ES wykazały,

że cząsteczki regulujące pluripotencję oraz samoodnawia-

nie należą do zaledwie kilku grup zawierających zbliżone

bądź identyczne sekwencje „seed”. Zarówno w mysich jak i

ludzkich komórkach ES wykrywane jest miR-302 [118,119],

oraz grupa cząsteczek miR-17/20/106, której odpowied-

nikiem w ludzkich komórkach ES jest grupa miR-17/92.

Grupą mikroRNA dominującą w mysich komórkach ES jest

miR-290. Do rodziny miR-290 zaliczamy sześć cząsteczek, od

miR-290 do miR-295. Są one obecne już w zygocie, najwyższy

ich poziom jest wykrywany w blastocyście, spada natomiast

podczas różnicowania komórek ES i nie jest obserwowany

w tkankach dorosłych organizmów [118,120,121]. Cząstecz-

ki miR-371-373, oraz miR-520 są obecne tylko w ludzkich

komórkach ES [118,119,122]. W tych komórkach szczegól-

nie duży udział w całej puli mikroRNA stanowią cząstecz-

ki z rodziny miR-302 składającej się z pięciu cząsteczek:

miR-302a — miR-302d oraz miR-367. Co ciekawe, sekwen-

cje „seed” grup miR-290 oraz miR-302 różnią się zaledwie

jednym nukleotydem [119].

MikroRNA z grupy miR-290 kontrolują samoodnawia-

nie i proliferację komórek ES hamując ekspresję kluczo-

wych regulatorów cyklu komórkowego. Wśród genów,

których ekspresja jest regulowana przez te mikroRNA są

geny kodujące m.in. pRb (ang. retinoblastoma suspectibility

protein) i pokrewne mu białko p130, które wiążąc czynniki

transkrypcyjne z rodziny E2F uniemożliwiają ekspresję cy-

kliny E, a więc kluczowego regulatora fazy S. Wspomnia-

ne mikroRNA regulują też ekspresję genu kodującego

p21cip1 inhibitora CDK [115,120,123]. Obniżają one także

poziom kinazy Lats2 (ang. large tumor suppressor, homolog

2), o której wiadomo, że negatywnie reguluje aktywność

kompleksu cyklina E/CDK2 [123]. W efekcie możliwa jest

wysoka aktywność kinaz CDK, a co za tym idzie możliwe

są nieograniczone podziały komórek ES. Funkcje cząste-

czek z rodzin miR-290 oraz miR-302 sprawiły, że są one

określane jako ESCC mikroRNA (ang. ES cell specific cell

cycle regulating miRNAs) [123]. Tak więc miR-290 pełnią

kluczową rolę w regulacji cyklu komórkowego komórek

ES. Udowodniono również, że nadekspresja tych cząste-

czek hamuje różnicowanie komórek ES w mezodermę oraz

komórki linii płciowej, nie powstrzymując różnicowania

w inne rodzaje komórek [121]. Analiza roli miR-290 w

początkowych etapach różnicowania mysich komórek ES

wykazała, że bezpośrednim celem miR-290 jest Dkk1 (ang.

Dickkopf-related protein 1), inhibitor ścieżki sygnałowej

WNT [124], która reguluje różnicowanie w mezodermę

oraz komórki linii płciowej. Nadekspresja miR-290 hamuje

ekspresję Dkk1, przez co przyczynia się do zahamowania

ekspresji Brachyury, który jest czynnikiem transkrypcyj-

nym specyficznym dla mezodermy oraz Stella, białka cha-

rakterystycznego m. in. dla komórek linii płciowej uczest-

niczącego w regulacji metylacji [121,125,126]. Ponadto

miR-290 i miR-302 działają przeciwstawnie do mikroRNA

z grupy let-7, o których wiadomo że promują różnicowa-

nie komórek [127,128]. Co ciekawe, let-7g, ulega ekspresji

w komórkach pluripotentnych ES (na promotorze tego mi-

kroRNA znajdują się Oct4, Sox2, Nanog, Tcf3). Dojrzewa-

nie let-7g jest jednak hamowane przez Lin28, białko, któ-

rego synteza znajduje się pod kontrolą tych samych czyn-

ników transkrypcyjnych. Dopiero zahamowanie ekspresji

Lin28, które następuje podczas różnicowania umożliwia

działanie let-7g [129]. MiR-290 oraz miR-302 uczestniczą

także w początkowych etapach różnicowania komórek ES,

kiedy dochodzi do metylacji promotora genu kodującego

Oct4. MikroRNA z tych grup hamują produkcję p130 [120].

Oprócz istotnej roli jaką to białko pełni w regulacji fazy G1

cyklu komórkowego zaangażowane jest ono także w kon-

trolę procesów różnicowania. Między innymi jest ono inhi-

bitorem metylotransferaz Dnmt3a oraz Dnmt3b odpowia-

dających za metylację promotora genu kodującego Oct4

[120]. Tak więc w odpowiednich warunkach mikroRNA

zamiast utrzymywać komórki ES w stanie niezróżnicowa-

nym hamują ekspresję czynników pluripotencji umożli-

wiając różnicowanie. W hamowaniu ekspresji czynników

152

www.postepybiochemii.pl

pluripotencji uczestniczą również inne mikroRNA, wśród

nich miR-134, miR-145, miR-296 oraz miR-470 [130,131].

Regulatory pluripotencji takie jak Oct4, Sox2, Nanog,

Tcf3 lokalizowane są na promotorach większości mikroR-

NA eksprymowanych specyficznie i preferencyjnie w my-

sich i ludzkich komórkach ES, w tym także na promoto-

rach miR-290 oraz miR-302 [129,132]. Część promotorów

mikroRNA, z którymi oddziałują Oct4, Sox2, Nanog, Tcf3

jest jednak nieaktywna. Spowodowane jest to obecnością

na nich białek z grupy Polycomb, oraz wysokim poziomem

metylacji H3K27. Ekspresja tych mikroRNA jest specyficzna

dla określonego kierunku różnicowania [129]. Przykładowo

ekspresja miR-9, którego promotor w komórkach ES jest

zajmowany przez czynniki warunkujące pluripotencję oraz

białka Polycomb, rośnie specyficznie w nerwowych ko-

mórkach progenitorowych, w których promotor miR-9 jest

wolny od modyfikacji H3K27me2/3 nałożonej przez biał-

ka Polycomb [129]. Obecność czynników pluripotencji na

promotorach mikroRNA charakterystycznych dla komórek

różnicujących świadczy więc o „gotowości” komórek ES do

rozpoczęcia różnicowania.

PODSUMOWANIE

Utrzymanie pluripotencji oraz zdolności do samoodna-

wiania populacji komórek ES podlega ciągłej regulacji, w

której niezwykle istotną rolę pełnią modyfikacje epigene-

tyczne. Chromatyna komórek ES tworzy unikalne środo-

wisko regulujące ekspresję genów odpowiedzialnych za

pluripotencję oraz samoodnawianie. Wyjątkowo wysoka

zawartość euchromatyny warunkowana przez kompleksy

remodelujące chromatynę, aktywujące ekspresję genów mo-

dyfikacje histonów, domeny

biwalentne oraz białka odpo-

wiadające za heterochromaty-

nizację obecne w nukleopla-

zmie, tworzą razem charak-

terystyczną, tzw. „otwartą”

strukturę chromatyny komó-

rek ES (Ryc. 3). Modyfikacje

takie jak acetylacja histonów,

metylacja lizyny 4 histonu H3,

oraz przebudowa chroma-

tyny przeprowadzana przez

Chd1 oraz kompleksy SWI/

SNF, umożliwiają ekspresję

genów których produkty re-

gulują proliferację komórek

ES. MikroRNA z grup miR-290

oraz miR-302 hamują synte-

zę m.in. inhibitorów cyklu

komórkowego

umożliwia-

jąc nieograniczone podziały

komórek ES. W tym samym

czasie kompleksy Polycomb

oraz modyfikacje histonów

takie jak metylacja lizyny 27

histonu H3 hamują ekspresję

genów odpowiedzialnych za

różnicowanie. Jednocześnie

aktywujące ekspresję genów

modyfikacje histonów, takie

jak acetylacja lizyn histonów H3 czy H4 oraz metylacja

H3K4 utrzymują geny odpowiedzialne za różnicowanie w

ciągłej gotowości do ekspresji. Podczas różnicowania ko-

mórek ES ich chromatyna przechodzi dramatyczne zmiany,

które są możliwe m.in. dzięki białkom HP1. Białka te, wraz

z białkami Polycomb, hamują ekspresję genów związanych

z pluripotencją, dzięki czemu utrzymują różne typy ko-

mórek w stanie zróżnicowanym. Dodatkowo mechanizmy

epigenetyczne pełnią często podwójna rolę: np. kompleksy

Polycomb oraz mikroRNA uczestniczą zarówno w utrzy-

maniu komórek ES w stanie niezróżnicowanym jak i w ini-

cjacji różnicowania. W niezróżnicowanych komórkach ES

hamują one ekspresję genów związanych z różnicowaniem

oraz inhibitory cyklu komórkowego i w rezultacie utrzymu-

ją stan pluripotentny. W momencie zmiany losu komórki,

hamują sprzężenie zwrotne odpowiadające za pluripoten-

cję i umożliwiają różnicowanie. Pytanie co jest czynnikiem

przełączającym między pluripotencją a różnicowaniem po-

zostaje otwarte.

PIŚMIENNICTWO

1. Waddington CH (1942) Epigenotype. Endeavour 1: 18-20
2. Haig D (2004) The (dual) origin of epigenetics. Cold Spring Harb

Symp Quant Biol 69: 67-70

3. Clapier CR, Cairns BR (2009) The biology of chromatin remodeling

complexes. Annu Rev Biochem 78: 273-304

4. Kiefer JC (2007) Epigenetics in development. Dev Dyn 236: 1144-

1156

5. Jones PA, Baylin SB (2007) The epigenomics of cancer. Cell 128: 683-

692

6. Ho L, Crabtree GR (2010) Chromatin remodelling during develop-

ment. Nature 463: 474-484

Rycina 3. Schemat zmian w obrębie chromatyny prowadzących do powstania „otwartej” struktury chromatyny charaktery-

stycznej dla komórek ES oraz heterochromatyny warunkującej proces różnicowania.

Postępy Biochemii 59 (2) 2013

153

7. Kawasaki H, Abe H (2012) Epigenetics in cancer and inflammation.

Personalized Medicine Universe 1: 7-12

8. Momcilovic O, Navara C, Schatten G (2011) Cell cycle adaptations

and maintenance of genomic integrity in embryonic stem cells and

induced pluripotent stem cells. Results Probl Cell Differ 53: 415-458

9. White J, Dalton S (2005) Cell cycle control of embryonic stem cells.

Stem Cell Rev 1: 131-138

10. Jaenisch R, Young R (2008) Stem cells, the molecular circuitry of plu-

ripotency and nuclear reprogramming. Cell 132: 567-582

11. Takahashi K, Yamanaka S (2006) Induction of pluripotent stem cells

from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined fac-

tors. Cell 126: 663-676

12. Cremer T, Cremer M (2010) Chromosome territories. Cold Spring

Harb Perspect Biol 2: a003889

13. Luo SW, Zhang C, Zhang B, Kim CH, Qiu YZ, Du QS, Mei L, Xiong

WC (2009) Regulation of heterochromatin remodelling and myoge-

nin expression during muscle differentiation by FAK interaction

with MBD2. EMBO J 28: 2568-2582

14. Schneider R, Grosschedl R (2007) Dynamics and interplay of nuclear

architecture, genome organization, and gene expression. Genes Dev

21: 3027-3043

15. Deniaud E, Bickmore WA (2009) Transcription and the nuclear peri-

phery: edge of darkness? Curr Opin Genet Dev 19: 187-191

16. Wiblin AE, Cui W, Clark AJ, Bickmore WA (2005) Distinctive nucle-

ar organisation of centromeres and regions involved in pluripotency

in human embryonic stem cells. J Cell Sci 118: 3861-3868

17. Bartova E, Galiova G, Krejci J, Harnicarova A, Strasak L, Kozubek

S (2008) Epigenome and chromatin structure in human embryonic

stem cells undergoing differentiation. Dev Dyn 237: 3690-3702

18. Audit B, Zaghloul L, Vaillant C, Chevereau G, d’Aubenton-Carafa

Y, Thermes C, Arneodo A (2009) Open chromatin encoded in DNA

sequence is the signature of ‘master’ replication origins in human

cells. Nucleic Acids Res 37: 6064-6075

19. Di Paola D, Rampakakis E, Chan MK, Zannis-Hadjopoulos M (2012)

Differential chromatin structure encompassing replication origins in

transformed and normal cells. Genes Cancer 3: 152-176

20. Butler JT, Hall LL, Smith KP, Lawrence JB (2009) Changing nuclear

landscape and unique PML structures during early epigenetic trans-

itions of human embryonic stem cells. J Cell Biochem 107: 609-621

21. Lo D, Lu H (2010) Nucleostemin: Another nucleolar “Twister” of the

p53-MDM2 loop. Cell Cycle 9: 3227-3232

22. Qu J, Bishop JM (2012) Nucleostemin maintains self-renewal of em-

bryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to

pluripotency. J Cell Biol 197: 731-745

23. Hirai H, Romanova L, Kellner S, Verma M, Rayner S, Asakura A,

Kikyo N (2010) Post-mitotic role of nucleostemin as a promoter of

skeletal muscle cell differentiation. Biochem Biophys Res Commun

391: 299-304

24. Lawrence JB, Clemson CM (2008) Gene associations: true romance

or chance meeting in a nuclear neighborhood? J Cell Biol 182: 1035-

1038

25. Zegalo M, Wiland E, Kurpisz M (2006) Topology of chromosomes in

somatic cells. Part 1. Postepy Hig Med Dosw (Online) 60: 331-342

26. de The H, Le Bras M, Lallemand-Breitenbach V (2012) The cell bio-

logy of disease: Acute promyelocytic leukemia, arsenic, and PML

bodies. J Cell Biol 198: 11-21

27. Efroni S, Duttagupta R, Cheng J, Dehghani H, Hoeppner DJ, Dash

C, Bazett-Jones DP, Le Grice S, McKay RD, Buetow KH, Gingeras

TR, Misteli T, Meshorer E (2008) Global transcription in pluripotent

embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2: 437-447

28. Golan-Mashiach M, Dazard JE, Gerecht-Nir S, Amariglio N, Fisher

T, Jacob-Hirsch J, Bielorai B, Osenberg S, Barad O, Getz G, Toren

A, Rechavi G, Itskovitz-Eldor J, Domany E, Givol D (2005) Design

principle of gene expression used by human stem cells: implication

for pluripotency. Faseb J 19: 147-149

29. Macia A, Munoz-Lopez M, Cortes JL, Hastings RK, Morell S, Luce-

na-Aguilar G, Marchal JA, Badge RM, Garcia-Perez JL (2011) Epi-

genetic control of retrotransposon expression in human embryonic

stem cells. Mol Cell Biol 31: 300-316

30. Ruan J, Ouyang H, Amaya MF, Ravichandran M, Loppnau P, Min

J, Zang J (2012) Structural basis of the chromodomain of Cbx3 bo-

und to methylated peptides from histone h1 and G9a. PLoS One 7:

e35376

31. Bannister AJ, Zegerman P, Partridge JF, Miska EA, Thomas JO, Al-

lshire RC, Kouzarides T (2001) Selective recognition of methylated

lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410: 120-

124

32. Meshorer E, Yellajoshula D, George E, Scambler PJ, Brown DT, Mi-

steli T (2006) Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in plu-

ripotent embryonic stem cells. Dev Cell 10: 105-116

33. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E (1999) DNA methyltransfera-

ses Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and

mammalian development. Cell 99: 247-257

34. Li E, Bestor TH, Jaenisch R (1992) Targeted mutation of the DNA

methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69: 915-

926

35. Bestor TH (2000) The DNA methyltransferases of mammals. Hum

Mol Genet 9: 2395-2402

36. Tuorto F, Liebers R, Musch T, Schaefer M, Hofmann S, Kellner S,

Frye M, Helm M, Stoecklin G, Lyko F (2012) RNA cytosine methy-

lation by Dnmt2 and NSun2 promotes tRNA stability and protein

synthesis. Nat Struct Mol Biol 19: 900-905

37. Irvine RA, Lin IG, Hsieh CL (2002) DNA methylation has a local ef-

fect on transcription and histone acetylation. Mol Cell Biol 22: 6689-

6696

38. Latham T, Gilbert N, Ramsahoye B (2008) DNA methylation in mo-

use embryonic stem cells and development. Cell Tissue Res 331: 31-

55

39. Kass SU, Landsberger N, Wolffe AP (1997) DNA methylation directs

a time-dependent repression of transcription initiation. Curr Biol 7:

157-165

40. Prendergast GC, Ziff EB (1991) Methylation-sensitive sequence-spe-

cific DNA binding by the c-Myc basic region. Science 251: 186-189

41. Kovesdi I, Reichel R, Nevins JR (1987) Role of an adenovirus E2 pro-

moter binding factor in E1A-mediated coordinate gene control. Proc

Natl Acad Sci USA 84: 2180-2184

42. Bednarik DP, Duckett C, Kim SU, Perez VL, Griffis K, Guenthner

PC, Folks TM (1991) DNA CpG methylation inhibits binding of NF-

-kappa B proteins to the HIV-1 long terminal repeat cognate DNA

motifs. New Biol 3: 969-976

43. Nan X, Ng HH, Johnson CA, Laherty CD, Turner BM, Eisenman

RN, Bird A (1998) Transcriptional repression by the methyl-CpG-

-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex.

Nature 393: 386-389

44. Villa R, Morey L, Raker VA, Buschbeck M, Gutierrez A, De Santis F,

Corsaro M, Varas F, Bossi D, Minucci S, Pelicci PG, Di Croce L (2006)

The methyl-CpG binding protein MBD1 is required for PML-RARal-

pha function. Proc Natl Acad Sci USA 103: 1400-1405

45. Hendrich B, Tweedie S (2003) The methyl-CpG binding domain and

the evolving role of DNA methylation in animals. Trends Genet 19:

269-277

46. Fujita N, Watanabe S, Ichimura T, Tsuruzoe S, Shinkai Y, Tachi-

bana M, Chiba T, Nakao M (2003) Methyl-CpG binding domain 1

(MBD1) interacts with the Suv39h1-HP1 heterochromatic complex

for DNA methylation-based transcriptional repression. J Biol Chem

278: 24132-24138

47. Kaji K, Nichols J, Hendrich B (2007) Mbd3, a component of the

NuRD co-repressor complex, is required for development of pluri-

potent cells. Development 134: 1123-1132

48. Murawska M, Brehm A (2011) CHD chromatin remodelers and the

transcription cycle. Transcription 2: 244-253

49. Lei H, Oh SP, Okano M, Juttermann R, Goss KA, Jaenisch R, Li E

(1996) De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse

embryonic stem cells. Development 122: 3195-3205

154

www.postepybiochemii.pl

50. Farthing CR, Ficz G, Ng RK, Chan CF, Andrews S, Dean W, Hem-

berger M, Reik W (2008) Global mapping of DNA methylation in

mouse promoters reveals epigenetic reprogramming of pluripoten-

cy genes. PLoS Genet 4: e1000116

51. Monk M, Boubelik M, Lehnert S (1987) Temporal and regional chan-

ges in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and

germ cell lineages during mouse embryo development. Develop-

ment 99: 371-382

52. Ramsahoye BH, Biniszkiewicz D, Lyko F, Clark V, Bird AP, Jaenisch

R (2000) Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells

and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proc Natl Acad

Sci USA 97: 5237-5242

53. Li JY, Pu MT, Hirasawa R, Li BZ, Huang YN, Zeng R, Jing NH, Chen

T, Li E, Sasaki H, Xu GL (2007) Synergistic function of DNA methyl-

transferases Dnmt3a and Dnmt3b in the methylation of Oct4 and

Nanog. Mol Cell Biol 27: 8748-8759

54. Fouse SD, Shen Y, Pellegrini M, Cole S, Meissner A, Van Neste L,

Jaenisch R, Fan G (2008) Promoter CpG methylation contributes to

ES cell gene regulation in parallel with Oct4/Nanog, PcG complex,

and histone H3 K4/K27 trimethylation. Cell Stem Cell 2: 160-169

55. Tsumura A, Hayakawa T, Kumaki Y, Takebayashi S, Sakaue M,

Matsuoka C, Shimotohno K, Ishikawa F, Li E, Ueda HR, Nakayama

J, Okano M (2006) Maintenance of self-renewal ability of mouse

embryonic stem cells in the absence of DNA methyltransferases

Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b. Genes Cells 11: 805-814

56. Panning B, Jaenisch R (1996) DNA hypomethylation can activate

Xist expression and silence X-linked genes. Genes Dev 10: 1991-2002

57. Bannister AJ, Kouzarides T (2011) Regulation of chromatin by histo-

ne modifications. Cell Res 21: 381-395

58. Kouzarides T (2007) Chromatin modifications and their function.

Cell 128: 693-705

59. Liu CL, Kaplan T, Kim M, Buratowski S, Schreiber SL, Friedman N,

Rando OJ (2005) Single-nucleosome mapping of histone modifica-

tions in S. cerevisiae. PLoS Biol 3: e328

60. O’Carroll D, Erhardt S, Pagani M, Barton SC, Surani MA, Jenuwein

T (2001) The polycomb-group gene Ezh2 is required for early mouse

development. Mol Cell Biol 21: 4330-4336

61. Stoller JZ, Huang L, Tan CC, Huang F, Zhou DD, Yang J, Gelb BD,

Epstein JA (2010) Ash2l interacts with Tbx1 and is required during

early embryogenesis. Exp Biol Med (Maywood) 235: 569-576

62. Chi P, Allis CD, Wang GG (2010) Covalent histone modifications--

-miswritten, misinterpreted and mis-erased in human cancers. Nat

Rev Cancer 10: 457-469

63. Azuara V, Perry P, Sauer S, Spivakov M, Jorgensen HF, John RM,

Gouti M, Casanova M, Warnes G, Merkenschlager M, Fisher AG

(2006) Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nat Cell Biol 8:

532-538

64. Krejci J, Uhlirova R, Galiova G, Kozubek S, Smigova J, Bartova E

(2009) Genome-wide reduction in H3K9 acetylation during human

embryonic stem cell differentiation. J Cell Physiol 219: 677-687

65. Markowetz F, Mulder KW, Airoldi EM, Lemischka IR, Troyanskaya

OG (2010) Mapping dynamic histone acetylation patterns to gene

expression in nanog-depleted murine embryonic stem cells. PLoS

Comput Biol 6: e1001034

66. Bernstein BE, Mikkelsen TS, Xie X, Kamal M, Huebert DJ, Cuff J,

Fry B, Meissner A, Wernig M, Plath K, Jaenisch R, Wagschal A, Feil

R, Schreiber SL, Lander ES (2006) A bivalent chromatin structure

marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 125:

315-326

67. Zhao XD, Han X, Chew JL, Liu J, Chiu KP, Choo A, Orlov YL, Sung

WK, Shahab A, Kuznetsov VA, Bourque G, Oh S, Ruan Y, Ng HH,

Wei CL (2007) Whole-genome mapping of histone H3 Lys4 and 27

trimethylations reveals distinct genomic compartments in human

embryonic stem cells. Cell Stem Cell 1: 286-298

68. Vastenhouw NL, Zhang Y, Woods IG, Imam F, Regev A, Liu XS,

Rinn J, Schier AF (2010) Chromatin signature of embryonic pluripo-

tency is established during genome activation. Nature 464: 922-926

69. Akkers RC, van Heeringen SJ, Jacobi UG, Janssen-Megens EM,

Francoijs KJ, Stunnenberg HG, Veenstra GJ (2009) A hierarchy of

H3K4me3 and H3K27me3 acquisition in spatial gene regulation in

Xenopus embryos. Dev Cell 17: 425-434

70. Schuettengruber B, Ganapathi M, Leblanc B, Portoso M, Jaschek R,

Tolhuis B, van Lohuizen M, Tanay A, Cavalli G (2009) Functional

anatomy of polycomb and trithorax chromatin landscapes in Droso-

phila embryos. PLoS Biol 7: e13

71. de la Serna IL, Ohkawa Y, Imbalzano AN (2006) Chromatin remo-

delling in mammalian differentiation: lessons from ATP-dependent

remodellers. Nat Rev Genet 7: 461-473

72. Schuettengruber B, Chourrout D, Vervoort M, Leblanc B, Cavalli G

(2007) Genome regulation by polycomb and trithorax proteins. Cell

128: 735-745

73. Ingham PW (1985) A clonal analysis of the requirement for the tri-

thorax gene in the diversification of segments in Drosophila. J Em-

bryol Exp Morphol 89: 349-365

74. Kennison JA, Tamkun JW (1988) Dosage-dependent modifiers of po-

lycomb and antennapedia mutations in Drosophila. Proc Natl Acad

Sci USA 85: 8136-8140

75. Boyer LA, Plath K, Zeitlinger J, Brambrink T, Medeiros LA, Lee TI,

Levine SS, Wernig M, Tajonar A, Ray MK, Bell GW, Otte AP, Vidal

M, Gifford DK, Young RA, Jaenisch R (2006) Polycomb complexes

repress developmental regulators in murine embryonic stem cells.

Nature 441: 349-353

76. Ryme J, Asp P, Bohm S, Cavellan E, Farrants AK (2009) Variations

in the composition of mammalian SWI/SNF chromatin remodelling

complexes. J Cell Biochem 108: 565-576

77. Ebbert R, Birkmann A, Schuller HJ (1999) The product of the SNF2/

SWI2 paralogue INO80 of Saccharomyces cerevisiae required for ef-

ficient expression of various yeast structural genes is part of a high-

-molecular-weight protein complex. Mol Microbiol 32: 741-751

78. Schuettengruber B, Martinez AM, Iovino N, Cavalli G (2011) Tritho-

rax group proteins: switching genes on and keeping them active.

Nat Rev Mol Cell Biol 12: 799-814

79. Kaeser MD, Aslanian A, Dong MQ, Yates JR, 3rd, Emerson BM

(2008) BRD7, a novel PBAF-specific SWI/SNF subunit, is required

for target gene activation and repression in embryonic stem cells. J

Biol Chem 283: 32254-32263

80. Bultman S, Gebuhr T, Yee D, La Mantia C, Nicholson J, Gilliam

A, Randazzo F, Metzger D, Chambon P, Crabtree G, Magnuson T

(2000) A Brg1 null mutation in the mouse reveals functional diffe-

rences among mammalian SWI/SNF complexes. Mol Cell 6: 1287-

1295

81. Kim JK, Huh SO, Choi H, Lee KS, Shin D, Lee C, Nam JS, Kim H,

Chung H, Lee HW, Park SD, Seong RH (2001) Srg3, a mouse homo-

log of yeast SWI3, is essential for early embryogenesis and involved

in brain development. Mol Cell Biol 21: 7787-7795

82. Gao X, Tate P, Hu P, Tjian R, Skarnes WC, Wang Z (2008) ES cell plu-

ripotency and germ-layer formation require the SWI/SNF chroma-

tin remodeling component BAF250a. Proc Natl Acad Sci USA 105:

6656-6661

83. Kidder BL, Palmer S, Knott JG (2009) SWI/SNF-Brg1 regulates self-

-renewal and occupies core pluripotency-related genes in embry-

onic stem cells. Stem Cells 27: 317-328

84. Ho L, Ronan JL, Wu J, Staahl BT, Chen L, Kuo A, Lessard J, Ne-

svizhskii AI, Ranish J, Crabtree GR (2009) An embryonic stem cell

chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic

stem cell self-renewal and pluripotency. Proc Natl Acad Sci USA

106: 5181-5186

85. Ho L, Jothi R, Ronan JL, Cui K, Zhao K, Crabtree GR (2009) An em-

bryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is an es-

sential component of the core pluripotency transcriptional network.

Proc Natl Acad Sci USA 106: 5187-5191

86. Singhal N, Graumann J, Wu G, Arauzo-Bravo MJ, Han DW, Greber

B, Gentile L, Mann M, Scholer HR (2010) Chromatin-Remodeling

Components of the BAF Complex Facilitate Reprogramming. Cell

141: 943-955

Postępy Biochemii 59 (2) 2013

155

87. Schaniel C, Ang YS, Ratnakumar K, Cormier C, James T, Bernstein

E, Lemischka IR, Paddison PJ (2009) Smarcc1/Baf155 couples self-

-renewal gene repression with changes in chromatin structure in

mouse embryonic stem cells. Stem Cells 27: 2979-2991

88. Persson J, Ekwall K (2010) Chd1 remodelers maintain open chroma-

tin and regulate the epigenetics of differentiation. Exp Cell Res 316:

1316-1323

89. Gaspar-Maia A, Alajem A, Polesso F, Sridharan R, Mason MJ, He-

idersbach A, Ramalho-Santos J, McManus MT, Plath K, Meshorer E,

Ramalho-Santos M (2009) Chd1 regulates open chromatin and plu-

ripotency of embryonic stem cells. Nature 460: 863-868

90. Kaji K, Caballero IM, MacLeod R, Nichols J, Wilson VA, Hendrich B

(2006) The NuRD component Mbd3 is required for pluripotency of

embryonic stem cells. Nat Cell Biol 8: 285-292

91. Koch HB, Zhang R, Verdoodt B, Bailey A, Zhang CD, Yates JR,

3rd, Menssen A, Hermeking H (2007) Large-scale identification of

c-MYC-associated proteins using a combined TAP/MudPIT appro-

ach. Cell Cycle 6: 205-217

92. Liang J, Wan M, Zhang Y, Gu P, Xin H, Jung SY, Qin J, Wong J, Co-

oney AJ, Liu D, Songyang Z (2008) Nanog and Oct4 associate with

unique transcriptional repression complexes in embryonic stem

cells. Nat Cell Biol 10: 731-739

93. Fazzio TG, Huff JT, Panning B (2008) An RNAi screen of chromatin

proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell

identity. Cell 134: 162-174

94. Mohan KN, Ding F, Chaillet JR (2011) Distinct roles of DMAP1 in

mouse development. Mol Cell Biol 31: 1861-1869

95. Bracken AP, Dietrich N, Pasini D, Hansen KH, Helin K (2006) Geno-

me-wide mapping of Polycomb target genes unravels their roles in

cell fate transitions. Genes Dev 20: 1123-1136

96. Richly H, Aloia L, Di Croce L (2011) Roles of the Polycomb group

proteins in stem cells and cancer. Cell Death Dis 2: e204

97. Casanova M, Preissner T, Cerase A, Poot R, Yamada D, Li X, Ap-

panah R, Bezstarosti K, Demmers J, Koseki H, Brockdorff N (2011)

Polycomblike 2 facilitates the recruitment of PRC2 Polycomb group

complexes to the inactive X chromosome and to target loci in embry-

onic stem cells. Development 138: 1471-1482

98. van der Stoop P, Boutsma EA, Hulsman D, Noback S, Heimerikx M,

Kerkhoven RM, Voncken JW, Wessels LF, van Lohuizen M (2008)

Ubiquitin E3 ligase Ring1b/Rnf2 of polycomb repressive complex

1 contributes to stable maintenance of mouse embryonic stem cells.

PLoS One 3: e2235

99. Buchwald G, van der Stoop P, Weichenrieder O, Perrakis A, van

Lohuizen M, Sixma TK (2006) Structure and E3-ligase activity of the

Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1b. Embo J

25: 2465-2474

100. Faust C, Lawson KA, Schork NJ, Thiel B, Magnuson T (1998) The

Polycomb-group gene eed is required for normal morphogenetic

movements during gastrulation in the mouse embryo. Development

125: 4495-4506

101. Pasini D, Bracken AP, Jensen MR, Lazzerini Denchi E, Helin K

(2004) Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 hi-

stone methyltransferase activity. Embo J 23: 4061-4071

102. Cao R, Wang L, Wang H, Xia L, Erdjument-Bromage H, Tempst P,

Jones RS, Zhang Y (2002) Role of histone H3 lysine 27 methylation in

Polycomb-group silencing. Science 298: 1039-1043

103. Li G, Margueron R, Ku M, Chambon P, Bernstein BE, Reinberg

D (2010) Jarid2 and PRC2, partners in regulating gene expression.

Genes Dev 24: 368-380

104. Walker E, Chang WY, Hunkapiller J, Cagney G, Garcha K, Torchia

J, Krogan NJ, Reiter JF, Stanford WL (2010) Polycomb-like 2 associa-

tes with PRC2 and regulates transcriptional networks during mouse

embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell

6: 153-166

105. Li X, Isono K, Yamada D, Endo TA, Endoh M, Shinga J, Mizutani-

-Koseki Y, Otte AP, Casanova M, Kitamura H, Kamijo T, Sharif J,

Ohara O, Toyada T, Bernstein BE, Brockdorff N, Koseki H (2011)

Mammalian polycomb-like Pcl2/Mtf2 is a novel regulatory com-

ponent of PRC2 that can differentially modulate polycomb activity

both at the Hox gene cluster and at Cdkn2a genes. Mol Cell Biol 31:

351-364

106. Walker E, Manias JL, Chang WY, Stanford WL (2011) PCL2 modu-

lates gene regulatory networks controlling self-renewal and com-

mitment in embryonic stem cells. Cell Cycle 10: 45-51

107. Lee TI, Jenner RG, Boyer LA, Guenther MG, Levine SS, Kumar RM,

Chevalier B, Johnstone SE, Cole MF, Isono K, Koseki H, Fuchikami

T, Abe K, Murray HL, Zucker JP, Yuan B, Bell GW, Herbolsheimer

E, Hannett NM, Sun K, Odom DT, Otte AP, Volkert TL, Bartel DP,

Melton DA, Gifford DK, Jaenisch R, Young RA (2006) Control of

developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem

cells. Cell 125: 301-313

108. Sato F, Tsuchiya S, Meltzer SJ, Shimizu K (2011) MicroRNAs and

epigenetics. FEBS J 278: 1598-1609

109. Axtell MJ, Westholm JO, Lai EC (2011) Vive la difference: bioge-

nesis and evolution of microRNAs in plants and animals. Genome

Biol 12: 221

110. Kim VN, Han J, Siomi MC (2009) Biogenesis of small RNAs in ani-

mals. Nat Rev Mol Cell Biol 10: 126-139

111. Tang F, Kaneda M, O’Carroll D, Hajkova P, Barton SC, Sun YA, Lee

C, Tarakhovsky A, Lao K, Surani MA (2007) Maternal microRNAs

are essential for mouse zygotic development. Genes Dev 21: 644-648

112. Krichevsky AM, King KS, Donahue CP, Khrapko K, Kosik KS

(2003) A microRNA array reveals extensive regulation of microR-

NAs during brain development. RNA 9: 1274-1281

113. Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, Meyer J, Lendeckel W,

Tuschl T (2002) Identification of tissue-specific microRNAs from

mouse. Curr Biol 12: 735-739

114. Wang Y, Medvid R, Melton C, Jaenisch R, Blelloch R (2007) DGCR8

is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic

stem cell self-renewal. Nat Genet 39: 380-385

115. Qi J, Yu JY, Shcherbata HR, Mathieu J, Wang AJ, Seal S, Zhou W,

Stadler BM, Bourgin D, Wang L, Nelson A, Ware C, Raymond C,

Lim LP, Magnus J, Ivanovska I, Diaz R, Ball A, Cleary MA, Ruohola-

-Baker H (2009) microRNAs regulate human embryonic stem cell

division. Cell Cycle 8: 3729-3741

116. Wang Y, Blelloch R (2011) Cell cycle regulation by microRNAs in

stem cells. Results Probl Cell Differ 53: 459-472

117. Murchison EP, Partridge JF, Tam OH, Cheloufi S, Hannon GJ

(2005) Characterization of Dicer-deficient murine embryonic stem

cells. Proc Natl Acad Sci USA 102: 12135-12140

118. Houbaviy HB, Murray MF, Sharp PA (2003) Embryonic stem cell-

-specific MicroRNAs. Dev Cell 5: 351-358

119. Suh MR, Lee Y, Kim JY, Kim SK, Moon SH, Lee JY, Cha KY, Chung

HM, Yoon HS, Moon SY, Kim VN, Kim KS (2004) Human embryonic

stem cells express a unique set of microRNAs. Dev Biol 270: 488-498

120. Sinkkonen L, Hugenschmidt T, Berninger P, Gaidatzis D, Mohn

F, Artus-Revel CG, Zavolan M, Svoboda P, Filipowicz W (2008) Mi-

croRNAs control de novo DNA methylation through regulation of

transcriptional repressors in mouse embryonic stem cells. Nat Struct

Mol Biol 15: 259-267

121. Zovoilis A, Smorag L, Pantazi A, Engel W (2009) Members of the

miR-290 cluster modulate in vitro differentiation of mouse embry-

onic stem cells. Differentiation 78: 69-78

122. Laurent LC, Chen J, Ulitsky I, Mueller FJ, Lu C, Shamir R, Fan

JB, Loring JF (2008) Comprehensive microRNA profiling reveals a

unique human embryonic stem cell signature dominated by a single

seed sequence. Stem Cells 26: 1506-1516

123. Wang Y, Baskerville S, Shenoy A, Babiarz JE, Baehner L, Blelloch

R (2008) Embryonic stem cell-specific microRNAs regulate the G1-S

transition and promote rapid proliferation. Nat Genet 40: 1478-1483

124. Semenov MV, Zhang X, He X (2008) DKK1 antagonizes Wnt sig-

naling without promotion of LRP6 internalization and degradation.

J Biol Chem 283: 21427-21432

125. Sato M, Kimura T, Kurokawa K, Fujita Y, Abe K, Masuhara M,

Yasunaga T, Ryo A, Yamamoto M, Nakano T (2002) Identification

156

www.postepybiochemii.pl

The alchemy — epigenetic regulation of pluripotency

Joanna Bem, Iwona Grabowska

*

Department of Cytology, Faculty of Biology, University of Warsaw, 1 Ilji Miecznikowa St., 02-096 Warsaw, Poland

*

e-mail: [e-mail]

Key words: chromatin, epigenetics, ES cells, pluripotency, self-renewing, differentiation

ABSTRACT

Embryonic stem cells (ESCs) self renew their population, also they are pluripotent which means they can differentiate into any given cell type.

In specific culture conditions they remain undifferentiated. On the cellular level pluripotency is determined by many transcription factors,

e.g. Sox2, Nanog, Klf4, Oct4. Epigenetic regulation is also crucial for both self renewal and pluripotency. This review focuses on epigenetic

mechanisms, among them DNA methylation, posttranslational histone modifications, ATP dependent chromatin remodeling and miRNAs

interactions. These mechanisms affect embryonic stem cells functions keeping them poised for differentiation.

of PGC7, a new gene expressed specifically in preimplantation em-

bryos and germ cells. Mech Dev 113: 91-94

126. Lindsley RC, Gill JG, Kyba M, Murphy TL, Murphy KM (2006)

Canonical Wnt signaling is required for development of embryonic

stem cell-derived mesoderm. Development 133: 3787-3796

127. Melton C, Blelloch R (2010) MicroRNA Regulation of Embryonic

Stem Cell Self-Renewal and Differentiation. Adv Exp Med Biol 695:

105-117

128. Melton C, Judson RL, Blelloch R (2010) Opposing microRNA fami-

lies regulate self-renewal in mouse embryonic stem cells. Nature

463: 621-626

129. Marson A, Levine SS, Cole MF, Frampton GM, Brambrink T,

Johnstone S, Guenther MG, Johnston WK, Wernig M, Newman J,

Calabrese JM, Dennis LM, Volkert TL, Gupta S, Love J, Hannett

N, Sharp PA, Bartel DP, Jaenisch R, Young RA (2008) Connecting

microRNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry of

embryonic stem cells. Cell 134: 521-533

130. Xu N, Papagiannakopoulos T, Pan G, Thomson JA, Kosik KS (2009)

MicroRNA-145 regulates OCT4, SOX2, and KLF4 and represses plu-

ripotency in human embryonic stem cells. Cell 137: 647-658

131. Tay Y, Zhang J, Thomson AM, Lim B, Rigoutsos I (2008) MicroR-

NAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic

stem cell differentiation. Nature 455: 1124-1128

132. Card DA, Hebbar PB, Li L, Trotter KW, Komatsu Y, Mishina Y,

Archer TK (2008) Oct4/Sox2-regulated miR-302 targets cyclin D1 in

human embryonic stem cells. Mol Cell Biol 28: 6426-6438